Deteção de doador Residual eritroide progenitoras após transplante de células-tronco hematopoéticas para pacientes com hemoglobinopatias
Summary
Quantificação de doador-derivado de células é necessária para monitorar a enxertia após transplante de células-tronco em pacientes com hemoglobinopatias. Uma combinação de classificação de celulares baseados em citometria de fluxo, ensaio de formação de colônia e posterior análise do tandem curta repetições podem ser utilizadas para avaliar a proliferação e diferenciação dos progenitores no compartimento eritroide.
Abstract
A presença de quimerismo incompleta é observada em uma grande proporção de pacientes após transplante de medula óssea para a talassemia major ou doença falciforme. Esta observação tem implicações tremendas, como estratégias de imunomodulação terapêutica subsequente podem melhorar os resultados clínicos. Convencionalmente, a análise baseada em reação em cadeia da polimerase de repetições curtas em tandem é usada para identificar o quimerismo em células de sangue de doadores-derivado. No entanto, esse método é restrito às células nucleadas e não conseguem distinguir entre linhagens de célula única dissociadas. Aplicamos a análise das repetições curtas em tandem para fluxo de células progenitoras hematopoiéticas cytometric-classificados e comparou-o com a análise de repetições curtas em tandem de unidades formadoras de estouro selecionada – eritroide colônias, ambos coletados do osso medula. Com este método… somos capazes de demonstrar as diferente proliferação e diferenciação das células do doador no compartimento eritroide. Esta técnica é elegível para completar o monitoramento atual de quimerismo em definindo o transplante de células estaminais e, portanto, pode ser aplicados estudos clínicos no futuro, investigação em células estaminais e design dos julgamentos de terapia de gene.
Introduction
Transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico (TCTH) é a abordagem curativa disponível apenas para uma variedade de desordens genéticas inatas do sistema hematopoiético, conseguindo taxas de sobrevida livre de doença de mais de 90% para outra forma altamente comprometida e vida útil limitada pacientes1. A eficácia desta importante ferramenta terapêutica foi otimizada ao limitar a toxicidade de pré- e pós-transplante de regimes2, mas também por intervenções destinadas a sustentar a função estável do enxerto, que é quantificada pelo acompanhamento atento da células de doador-derivado de4,3,5.
Em geral, o quimerismo completo (CC) implica a substituição total do compartimento lymphohematopoietic pelo doador-derivado de células, enquanto o termo misturado quimerismo (MC) é usado quando o doador e receptor derivada de células estão presentes simultaneamente em vários proporções. Quimerismo Split (SC) denota a coexistência de quimerismo misto observada em linhagens de célula única, tal como no compartimento eritroide. Determinação rápida do status de quimerismo após TCTH é fundamental, como pode ajudar a identificar os pacientes suscetíveis para recidiva da doença e estratégias de iniciar immunomodulatory subsequentes, como infusões de linfócitos do doador ou redução de imunossupressores terapias6.
Vários métodos foram desenvolvidos para o monitoramento de enxertia após TCTH. Segundo de imunoglobulinas e análise citogenética tem sensibilidade pobre e são limitados em sua capacidade de detectar o polimorfismo7,8. A introdução de hibridação fluorescente em situ (FISH) pode aumentar a sensibilidade no acompanhamento de quimerismo após TCTH, mas é restrita ao sexo-incompatíveis aloenxertos9. Atualmente, a reação em cadeia da polimerase (PCR) é o mais difundido método usado para detectar quimerismo e baseia-se na electroforese do gel de agarose-acrilamida convencional das repetições em tandem de número variável (alelos) ou repetições de curta em tandem (STRs). Usada rotineiramente o PCR quantitativo é capaz de detectar uma extremamente pequena proporção de células de doador residual após TCTH. A grande limitação dos estudos até agora é que MC deteção é quase exclusivamente limitada a presença de células nucleadas, ao invés de eritrócitos maduros, ou seja, as células que é funcionalmente crucial para os pacientes afetados por hemoglobinopatias. Em pacientes com diferentes grupos de sangue, vale lembrar que a análise cytofluorometric é capaz de identificar quimerismo em glóbulos vermelhos, utilizando anticorpos monoclonais dirigidos eritrócitos antígenos ABO e C, c, D, E e e10 , 11. um meio diferente, mas muito interessante de avaliar quimerismo na linhagem eritroide é a combinação de fluxo cytometric classificação dos progenitores eritroide e seleção de vários tipos de progenitor eritroide pelo cultivo em ensaios de clonogenic, seguido de análise de STR12. Esta abordagem é capaz de quantificar as proporções relativas de quimerismo doador-versus-receptor no compartimento eritroide e pode ser utilizada na estratégia para sustentar o enxerto de medula óssea.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo do estudo atual é fornecer ao público uma combinação das duas abordagens para analisar quimerismo doador/beneficiário em eritroide progenitores após TCTH em pacientes tratados para hemoglobinopatias: 1.) classificação de fluorescência-ativado da pilha de células progenitoras hematopoiéticas em amostras de medula óssea, seguidas de análise de repetições curtas em tandem e 2.) unidade formadoras de cultivo de células de medula óssea, a classificação das colônias em vários tipos de progenitor…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
Referenzen
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
