Методы и советы для внутривенного введения аденоассоциированный вирус для крыс и оценки трансдукции центральной нервной системы
Summary
Рассматриваются методы для доставки генов широкомасштабной центральной нервной системы, крыса. В этом примере предназначен для имитации заболевание, которое влияет на весь спинной. Широко трансдукции может использоваться для доставки терапевтических белков ЦНС от одноразовых, периферических администрации.
Abstract
Аденоассоциированный вирус (AAV) векторы являются ключевым реагента в нейробиологии кластерного регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ), Оптогенетика, КРР lox ориентации и т.д. Цель этой рукописи заключается в помощи следователь, попытки переноса генов экспансивного центральной нервной системы (ЦНС) крыс через хвост инъекции Вену AAV. Масштабное выражение имеет важное значение для условий с широко распространенной патологией, а крысы модель является значительным из-за его большего размера и физиологического сходства для людей, по сравнению с мышей. В этом примере приложения широкомасштабные нейрональных трансдукции используется для имитировать нейродегенеративные болезни, которая затрагивает весь спинного мозга, боковой амиотрофический склероз (ALS). Эффективное широкомасштабное ЦНС трансдукции также может использоваться для доставки терапевтических белков факторов в доклинических исследований. После интервала впрыска выражение несколько недель оцениваются последствия трансдукции. Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) управления вектора количество GFP в мозжечке оценивается быстро и надежно базовой программы обработки изображений. Для мотор болезни фенотипов, которые индуцированных ALS связанных с белком transactive ответ ДНК связывающих белков 43 кДа (TDP-43), дефицит забил побег рефлекс и rotarod. Помимо моделирования заболевания и генной терапии есть различных потенциальных приложений для ориентации масштабе гена, описанных здесь. Расширенное использование этого метода будет помощь в ускорении гипотез в нейробиологии и нейрогенетики.
Introduction
Рекомбинантных аденоассоциированный вирус (AAV) векторы являются незаменимыми инструментами для исследования ЦНС, потому что они настолько эффективны для преобразователя нейронов в естественных условиях. Векторы AAV очень универсальны для изучения различных трансгенов и изоформ белка, различных тканей, различными видами и различные маршруты администрации. Например Аав может управляться мышей периферических, относительно неинвазивный, внутривенные инъекции передавать нейронов в ЦНС, впервые описаны в Фоаст et al. и Дуке и др. (см. JOVE документ, Gombash и др. (2014)). 1 , 2 , 3 этот ген доставки подход используется в крыс эффективно выражать либо Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) или ALS связанные белком, transactive ответ ДНК связывающих белков 43 кДа (TDP-43) в ЦНС. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 работа крыс важна потому, что крыса физиологических и метаболических параметров ближе к людям по сравнению с мышей и есть поведенческих и токсикологические анализы, разработанный специально для крыс. Кроме того, более трансгенных крыс линии становятся доступными, могут быть использованы в AAV гена передачи исследований.
Методы подробно для экспансивного переноса генов ЦНС в крыса и быстрой, надежной количественной оценки результатов. Широкомасштабные ЦНС трансдукции используется для имитации симптоматика ALS крыс, выразив TDP-43 во всем спинного. Этот метод является инъекции Вену хвост TDP-43 вектора для молодых взрослых крыс используется в Джексон и др. 6 , 8 , 9 после нескольких недель, TDP-43-индуцированной моторного дефицита забил двумя методами: побег рефлекс и rotarod, используемый в Дейтоне et al. и Джексон и др. 5 , 6 , 7 , 9 для управления GFP вектор, в посмертный анализ, флуоресцентный области мозжечка рассчитывается как индекс электромеханической эффективности, используемые в Джексон и др. 6 , 8 анализ мозжечка оказался быстрый и надежный индекс степени трансдукции ЦНС после родов периферийных гена и должен быть применим к целый ряд подходов, попытки переноса генов периферической и Центральной.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целый ряд маршрутов доставки были протестированы на векторы AAV: интра Паренхиматозный, интра которых, интра гнойный, внутривенно, интраназально, межмышечная, и т.д. Каждый маршрут может иметь определенные преимущества, а также недостатки. Хвост вен отправления AAV для взрослых крыс являе?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась ALS ассоциация, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx и благотворительные пожертвования для ALS исследований от Томас Лоусон, для которой мы благодарны. Мы благодарим Elysse Орчард и Донна Burney для консультаций и подготовки кадров. ДЖАС был поддержан фондом лгал и национальных институтов здравоохранения грант GM103418.
Materials
| Scale | Pelouze | SP5 | |
| Nalgene bucket | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
| Microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Lactated Ringer's Solution | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
| Mini vortexer | Fisher Scientific | 128101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22624415 | |
| Laboratory film | Bemis | PM996 | |
| 1-mL syringe | BD | 309626 | Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection |
| 30g needle | BD | 305106 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250 mL |
| Anesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Gauze | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
| Pipet tips | USA Scientific | 1111-0816 | |
| Micropipet | Gilson | 4642080 | |
| Gas anesthesia vaporizer | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
| Gas anesthesia scavenger | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
| Heating pad | Sears | 17280 | |
| Bench pad | VWR | 56617-006 | |
| Rotarod | Panlab/Harvard Apparatus | 76-0772 | 4 rats/ 4 mice |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 proof |
| 70% Isopropanol | VWR | 89108-160 | |
| Scion Image | Scion Corporation | ||
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen | A11122 | Primary Antibody – 1:500 dilution |
| AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11070 | Secondary Antibody – 1:300 dilution |
| Axioskop 40 microscope | Zeiss |
Referenzen
- Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
- Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
- Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
- Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).
- Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
- Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).
- Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69 (2016).
- Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
- Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
- van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).
