Спектроскопия силы одного белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа
Summary
Мы описываем подробных процедур и стратегий для измерения механических свойств и механических разворачивается пути единого белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа. Мы также показать представителя результаты как ссылку для выбора и обоснования хороший один белок молекулы записей.
Abstract
Определение процесса складывания белков от их аминокислотной последовательности в их родной 3D структура является важной проблемой в биологии. Атомно-силовой микроскопии (АСМ) могут решить эту проблему, позволяя растяжение и расслабление одного белковых молекул, которая дает прямых доказательств конкретные разворачивается и складывая характеристики. На базе AFM одной молекулы силой спектроскопии (AFM-SMF) предоставляет средства для последовательно измерения высокоэнергетических конформации в белки, которые не возможны в традиционных массовых (биохимические) измерений. Хотя многочисленные документы были опубликованы Показать принципы AFM-функций SMF, это не легко для проведения экспериментов SMF-функций из-за отсутствия исчерпывающе полной протокола. В этом исследовании мы кратко проиллюстрировать принципы AFM и широко подробно протоколов, процедур и анализ данных в качестве ориентира для достижения хороших результатов от экспериментов SMF-функции. Мы продемонстрировать представитель SMF-функций результаты одного белка механические разворачивается измерений и мы предоставляем стратегии устранения неполадок для некоторых часто возникающих проблем.
Introduction
Достижения в одной молекулы силой спектроскопии (SMF) на AFM позволили механические манипуляции и точная характеристика одного белковых молекул. Эта характеристика выпустила новые идеи о белка механики1,2, белка складной3, белок лиганд взаимодействия4, белок белковых взаимодействий5, и на основе белков инженерии материалы6,,78. Эти функции особенно полезны для изучения белков разворачивается, как растяжения, АСМ позволяет химических и физических связей внутри молекулы белка постепенно расширить согласно их жесткость, которая порождает постоянно растущего контурная длина. Этот распыления белковой молекулы могут производить резкий переход в кривой силы расширение, что приводит к разрыву событие (или силы пик). Пик сил дает прямую информацию о разворачивающихся силы и структурные изменения белка во время механической разворачивающегося процесса. Один из первых исследований с помощью AFM измеряется Титин1 и нашли новые аспекты белка разворачивается и складывая в физиологических условиях без использования неестественным denaturants как концентрированных химических веществ или экстремальных температур.
SMF-функции эксперименты проводятся на целый ряд инструментов, хотя здесь мы рассмотрим только AFM. AFM состоит из четырех основных элементов: зонд, детектор, держателя образца и пьезоэлектрические сканера. Зонд является острый кончик на самозванца конце кантилевера. После калибровки изгиба кантилевера при растяжении прилагаемый молекулы измеряется с помощью лазерного луча, который отражается от задней стороне кантилевера точно определить силы, используя закон Гука. Проекты отраженного лазерного луча в квадрант фотодиод детектор, который производит напряжения пропорционально перемещению лазерного луча из центра диода. Подложке, с образец протеина в жидкости монтируется на 3D пьезоэлектрический сцену, которая может управляться с суб нанометровой точностью. Компьютер считывает напряжение от детекторов фотодиод и контролирует 3D сцене через компьютерным управлением напряжения питания. Эти этапы привод piezo обычно оборудованы с емкостным или тензометрические датчики положения именно мера пьезо перемещения и правильно гистерезиса через систему обратной связи управления. Выходной сигнал датчика от контроллера пьезо преобразуется в расстоянии с помощью напряжения константа piezo который завод Калиброванный. Пример кривой силы расширение от потянув эксперимента показано на рисунке 2.
Существует два типа функций SMF AFM экспериментов: постоянная скорость и постоянной силой потянув измерений. Измерения постоянной силы SMF-функции описаны в Oberhauser и др. 9, хотя здесь мы сосредоточены на постоянной скорости измерения. Типичный AFM константа скорости потянув эксперимент осуществляется путем предоставления напряжения пьезо осторожно двигаться подложке относительно кончика консольный. Типичная эксперимент имеет наконечник, сначала нажав против поверхности. Вытягивая измерение начинается перемещение подложки от кончика довести из контакта. Если белок прикоснулась кончик изначально, он будет быть вытащил и разворачивается след силы против перемещения будет оцениваться. Субстрат затем возвращается контакт с кончика и расслабляющий след измеряется где сворачивания белка может быть определено из перемещения сил.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важнейшим шагом в протоколе является использование polyprotein, описанный в шаге 1.1.2, который служит в качестве позитивного элемента управления «отпечатки пальцев» сингл молекула события. Как правило, должны разворачиваются события polyprotein белков (для I91, это означает разворачиваются силы ок…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальный научный фонд грантов MCB-1244297 и MCB-1517245 к PEM.
Materials
| AFM Specimen Discs, 15mm diameter | Ted Pella, Inc. | 16218 | Serve as base for glass substrate |
| Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick | Ted Pella, Inc. | 26024 | serve as glass substrate and base for gold coating |
| Adhesive Tabs | Ted Pella, Inc. | 16079 | Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips |
| STD Multimode head assembly | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM head |
| Glass probe holder | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM. |
| Microlever AFM probes | Bruker Nano Inc. | MLCT | Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes |
| AFM probes with Au coated tips | Bruker Nano Inc. | OBL-10 | Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force |
| Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs | National Instruments | PCI-6259 | Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface |
Referenzen
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
- Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
- Rico, F., Chu, C., Moy, V. T., Braga, P. C., Ricci, D. . Methods in Molecular Biology. 736, 331-353 (2011).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
- Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
- Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
- Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
- Davis, L. . Basic methods in molecular biology. , (2012).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
- Scholl, Z. N. . The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , (2016).
- Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
- . Nanopuller Available from: https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018)
- Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
- Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
- Su, T., Purohit, P. K. Mechanics of forced unfolding of proteins. Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).
- Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
- Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).
- Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
- Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
- He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
- Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
- Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
- Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
- Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).
