Мы представляем установку регистрации записи и протокол, который позволяет автоматизировать анализ нематод, предпочтение Caenorhabditis elegans для растворимых соединений в популяционном анализе. В этой статье описывается построение камеры поведения, протокола поведенческого анализа и использования программного обеспечения для анализа видео.
Нематода, компактная нервная система Caenorhabditis elegans , состоящая всего из 302 нейронов, лежит в основе разнообразного репертуара поведения. Для облегчения диссекции нейронных схем, лежащих в основе этих поведений, необходимо разработать надежные и воспроизводимые поведенческие анализы. Предыдущие исследования поведения C. elegans использовали вариации «теста на падение», «анализ хемотаксиса» и «анализ на удерживание» для исследования реакции C. elegans на растворимые соединения. Способ, описанный в этой статье, направлен на объединение дополнительных преимуществ трех вышеупомянутых анализов. Вкратце, маленький круг в середине каждой аналитической пластины делится на четыре квадранта с поочередно расположенными контрольными и экспериментальными решениями. После добавления червей аналитические пластины загружают в поведенческую камеру, где камеры микроскопа записывают встречи червей с обработанными областями. Затем автоматизированный видеоанализ выполняетсяИ генерируется значение индекса предпочтения (PI) для каждого видео. Возможности сбора видео и автоматического анализа этого метода минимизируют участие экспериментатора и любые связанные с ним ошибки. Кроме того, минимальное количество экспериментального соединения используется для каждого анализа, а установка с несколькими камерами поведенческой камеры увеличивает экспериментальную пропускную способность. Этот метод особенно полезен для проведения поведенческих экранов генетических мутантов и новых химических соединений. Однако этот метод не подходит для изучения навигации по градиенту стимула из-за непосредственной близости областей управления и экспериментального решения. Он также не должен использоваться, когда доступно лишь небольшое количество червей. Несмотря на то, что он подходит для анализа ответов только на растворимые соединения в его нынешней форме, этот метод можно легко модифицировать с учетом мультимодального сенсорного взаимодействия и оптико-генетических исследований. Этот метод также может быть адаптирован для анализа хемосенсорных реакций других видов нематод. </р>
Кормящие животные должны интегрировать материалы из нескольких сенсорных модальностей и выбирать соответствующие стратегии поведения, чтобы успешно ориентироваться в своей среде. Понимание того, как внешние сенсорные входы принимаются и трансдуцируются в нейронную информацию для направления выбора действия, является центральной целью в области нейробиологии. Генетически поддающаяся нематодам C. elegans – привлекательный модельный организм, в котором изучаются нейронные механизмы, лежащие в основе сенсорной биологии и мультимодальной интеграции. Хотя C. elegans имеет только 302 нейрона, он может обнаруживать и различать широкий спектр экологических стимулов, включая растворимые соединения, летучие одоранты и температуру окружающей среды 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 .Нематод C. elegans в значительной степени полагается на свой хемосенсорный аппарат, чтобы локализовать источники пищи и предупреждать себя о потенциальных угрозах. Таким образом, поведенческие анализы, предназначенные для скрининга ответов дикого типа и мутантного C. elegans на химические раздражители, играют решающую роль в анализе генетических, клеточных и нервных механизмов, связанных с замечательными сенсорными способностями C. elegans .
Для анализа реакции на растворимые соединения были описаны три типа анализов – тест на падение, анализ хемотаксиса и анализ на удерживание. В тесте на каплю небольшая капля соединения помещается в хвост движущегося червя, и решение червя перевернуть или продвинуться вперед, когда жидкость достигнет передней сенсорной аппаратуры, оценивается 4 . Тест на падение требует небольшой экспериментальной подготовки и полезен, когда размер образцов червей мал, как в случае с лазерными червями. Однако, поскольку только один червьМогут быть проанализированы одновременно, и экспериментатор должен присутствовать на протяжении всего анализа, тест на падение может занять много времени. Тест на падение также уязвим для изменений в доставке капель между каждым червем в образце, что может влиять на общие результаты анализа. Другим ограничением теста на падение является то, что его можно использовать только для анализа реакции червя на аверсивные соединения, поскольку невозможно отличить привлекательный или нейтральный эффект соединения от движения вперед червя.
Анализ хемотаксиса на растворимые соединения обычно включает разделение пластины агара на четыре квадранта, при этом экспериментальный раствор смешивают с агаром из двух противоположных квадрантов, а контрольный раствор смешивают в двух других квадрантах 8 , 9 . В начале анализа в центре пластины помещается капля буфера с червями, а количество червей в Каждый квадрант оценивается в разные моменты времени. Анализ хемотаксиса обеспечивает большую статистическую мощность по сравнению с тестом на падение, поскольку большое количество червей тестируется в каждом анализе. Однако одним ограничением этого метода является то, что для приготовления пластинок для анализа хемотаксиса требуются большие количества экспериментального соединения. Это затруднит проведение крупномасштабных экранов поведения, если для получения интересующего соединения требуется сложный процесс очистки с ограниченными выходами, как в случае сигнальных молекул аскаросидов 10 . Кроме того, ручной подсчет червей во всем анализе подвержен ошибкам, и возмущение пластин во время процесса подсчета может повлиять на результаты.
В отличие от двух вышеупомянутых методов анализ удерживания использует машинное зрение, которое минимизирует ошибку во время процесса подсчета очков и уменьшает интерференцию экспериментатора во время анализа > 11. Компьютеризированный анализ видеозаписей поведения червя также может потенциально выявлять более тонкую поведенческую динамику, которая будет пропущена, когда подсчет очков будет выполняться только в несколько отдельных временных периодов. В анализе удержания на противоположных сторонах небольшого кругового бактериального пищевого патча добавляются пятна двух растворов с последующим размещением небольшого количества червей в середине пищевого пятна. Затем поведение червей записывается, анализируется и значение индекса предпочтения рассчитывается на основе общего количества пикселей червя в каждой области решения. Хотя наличие привлекательного паттерна для пищи позволяет использовать меньшие популяции червей в каждом анализе, ранее было показано, что пища проявляет склонность избегать поведения к растворимым репеллентам 12 . Кроме того, черви проявляют светоподобный отклик на коротковолновый свет и использование источников света микроскопа, излучающих белый свет при установке записи по поведению, может повлиять на поведениеS = "xref"> 13.
Цель метода, обсуждаемого в этой статье, – записать и проанализировать предпочтение C. elegans для растворимых соединений с использованием популяционного анализа. С этой целью текущий метод интегрирует и улучшает аспекты из всех трех ранее обсуждавшихся методов. Это позволяет тестировать большие популяции червей, и для каждого анализа требуется только небольшое количество экспериментального раствора. Кроме того, анализ проводится в специально построенной закрытой поведенческой камере с инфракрасной светодиодной подсветкой для минимизации влияния коротковолнового света на поведение. Каждая камера также может быть оснащена несколькими камерами микроскопа, что увеличивает экспериментальную пропускную способность без ущерба для пространства для стенда. Наконец, программное обеспечение для анализа видео выводит значение индекса предпочтения для каждого видео, а также график сопровождающего червя, чтобы визуализировать динамику популяционного поведения с течением времени. Настройка камеры иПротокол ssay может быть дополнительно модифицирован для изучения мультимодальных реакций поведения, таких как влияние одорантов или температуры на хемосенсорное поведение.
В этой статье описывается конструкция камеры поведения и протокола анализа. Он также демонстрирует полезность этого метода при анализе реакции червей дикого типа и хемосенсорных дефектных мутантов на известный растворимый репеллент, ионы меди 4 . Наконец, подробный анализ процесса видеоанализа с использованием предоставленного программного обеспечения.
Критическим шагом в протоколе является обеспечение того, чтобы аналитические пластины имели согласованный уровень сухости в разные экспериментальные дни. Различные уровни сухости приведут к разной скорости диффузии раствора в агар и, следовательно, к изменениям поведенческого результата. Таким образом, аналитические пластины всегда должны быть свежими во второй половине дня перед экспериментами. Количество протестированных червей на анализ также должно регулироваться для удобства сравнения между обработками. Для справки, червь дикого типа откладывает 4-10 яиц / ч в среднем, давая> 360 червей на анализ, если соблюдается протокол синхронизации червя выше. 17 . Если определенные мутантные штаммы являются дефектными для яиц, подберите больше взрослых взрослых червей для укладки яиц, чтобы достичь целевого количества потомства. Другим важным шагом в протоколе является осторожное обращение с червями во время процесса стирки и размещения червя. Черви чувствительны к механическим раздражителям, которые вызывают реакции стресса, такие как S и торможение яйцекладки 18 . Кроме того, необходимо тщательно определить ROI и определить оптимальное значение порога для конкретных условий освещения, прежде чем приступать к анализу видео. Также рекомендуется повторять процесс калибровки и порогового значения, если длительный период времени истек с момента последнего эксперимента.
Ограничение этого метода заключается в том, что оно не подходит для анализа небольших популяций червя. Однако, если соответствующие меры контроля для определения влияния присутствия пищи на сенсорное поведение выполняются, то использование этой пищи для ограничения пространственного разведочного местоположения червей, как и в анализе удержания, также возможно с этой установкой. Кроме того, этот метод не предназначен для изучения навигации по градиенту стимулов из-за непосредственной близости и небольших количеств используемых контрольных и экспериментальных растворов.
E_content "> В будущем в эту систему можно интегрировать программное обеспечение для программирования, обеспечивающее отслеживание нескольких червей и извлечение одной червя, в эту систему 19 , 20. Запись тонких параметров поведения поведения одного червя, таких как скорости разворота и амплитуда изгибов тела, обеспечит Более детальную картину хемосенсорного поведения отдельного червя в контексте популяционного анализа. Анализ также может быть изменен для изучения привыкания путем сверления отверстий через ROI с использованием игл шприца с соответствующим размером калибра и заполнения отверстий агаром, наполненным С экспериментальным соединением или контрольным буфером, что обеспечит более постоянную поверхностную концентрацию соединения в течение более длительного периода времени записи, что необходимо во время изучения привыкания. Другим потенциальным применением этого метода является проведение сравнительных исследований поведения различных видов нематод. Кроме того, камера поведенияМогут быть модифицированы различными способами для изучения поведенческих реакций на мультимодальные стимулы. Для оптогенетических применений высокоинтенсивные светодиодные матрицы могут быть прикреплены рядом с держателем камеры для избирательной активации интересующих нас нейронов во время анализа. Нагревательные элементы, системы охлаждения и температурные датчики также могут быть добавлены в установку для изучения влияния температуры на сенсорное поведение. Кроме того, в кабине могут быть установлены системы доставки запаха, чтобы исследовать взаимодействия между аторсенсорными и хемосенсорными модальностями.The authors have nothing to disclose.
Некоторые штаммы были предоставлены Центром генетических исследований Caenorhabditis (CGC), который финансируется NIH Office Research Infrastructure Program (P40 OD010440). Эта работа поддерживается Медицинским институтом Говарда Хьюза, с которым PWS является исследователем.
Aluminum T-slotted framing extrusions | McMaster-Carr | 47065T101 | Single profile, 1" size, solid |
Brackets | McMaster-Carr | 47065T236 | 1" long for 1" high single profile extrusions |
Compact end-feed fasteners | McMaster-Carr | 47065T139 | 1" (single), pack of 4 |
Twist-in solid panel holders | McMaster-Carr | 47065T251 | For 1" high extrusion |
Plastic end caps | McMaster-Carr | 47065T91 | For 1" high extrusion |
Optically clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K211 | 3/16" thick, 12" x 12" |
Vinyl-coated polyester fabric | McMaster-Carr | 88505K57 | 0.027" thick, 61" width, black |
Brass grommets | McMaster-Carr | 9604K22 | Trade size 0, 0.545" outer diameter |
Steel washers | McMaster-Carr | 90107A029 | 1/4" screw size |
Rounded head screws | McMaster-Carr | 90272A546 | 1/4"-20 thread size, 1-1/2" long |
Standard operating backlight | Smart Vision Lights | See local vendor | 8"x8", infrared 850nm |
IVP-C1 Variable Control Pot | Smart Vision Lights | See local vendor | |
T1 Power Supply | Smart Vision Lights | See local vendor | |
Dino lite Pro AM4113T | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor | |
MS09B microscope stand | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor |