Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme
Summary
Biz hızlı katlanır ve etkileşimleri ile thermolabile ligandlar diferansiyel tarama Kalorimetre kullanarak bağlama biyomoleküler karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Diferansiyel kalorimetre tarama (DSC) miktarının biyomoleküler katlama ve bağlama etkileşimleri yöneten termodinamik parametreler için bir güçlü bir tekniktir. Bu bilgiler yeni ilaç bileşikler tasarımda önemlidir. Ancak, birçok pharmaceutically ilgili ligandlar DSC analizleri içinde kullanılan yüksek sıcaklıklarda kimyasal olarak kararsız vardır. Ligandlar ve termal olarak dönüştürülür ürünleri konsantrasyonları Kalorimetresi hücre içinde sürekli değişiyor çünkü böylece, bağlama etkileşimleri ölçme meydan okuyor. Burada, thermolabile ligandlar ve DSC dönüştürme işlemleri hızla katlama, bağlama ve ligand termodinamik ve Kinetik bilgi almak için bir iletişim kuralı’nı mevcut. DNA aptamer thermolabile ligand kokain bağlar MN4 için bizim yöntem uygulamış. Thermolabile ligand dönüştürme için hesapları yeni bir küresel uygun analiz kullanarak, tam bir katlama ve bağlama parametreler kümesi elde DSC deneyler bir çifti. Buna ek olarak, gösterdiğimiz oranı sabit thermolabile ligand dönüşüm için yalnızca bir ek DSC veri kümesi ile temin edilebilir. Biomolecule, yavaş katlanır, yavaş bağlama ve thermolabile ligand hızlı tükenmesi geri dönüşü olmayan toplama dahil olmak üzere belirlenmesi ve birkaç daha karmaşık senaryo verileri analiz etmek için yönergeler sunulmaktadır.
Introduction
Diferansiyel kalorimetre tarama (DSC) quantitating biyomoleküler bağlama ve katlama etkileşimleri1,2,3için güçlü bir yöntem olduğunu. DSC gücü onun yetenek bağlama ve mekanizmaları katlama aydınlatmak ve karşılık gelen termodinamik parametreler2,3verim için içerir. Ayrıca, DSC çözüm fizyolojik koşullar altında gerçekleştirilebilir ve etiketleme biomolecule veya ligand, örneğin, fluorophores, spin-etiketleri veya nükleer izotoplar4gerektirmez. Araç biomolecule ligand de denatüre için gereken ısı miktarı ölçüm sıcaklığı, inceden inceye gözden geçirmek. Elde edilen yerlerde ligand bağlayıcı ve süreçleri katlama yöneten termodinamik parametreler ayıklamak için kullanılır. DSC veya diğer termodinamik teknikleri tarafından sağlanan bilgi uyuşturucu biomolecules1,5,6,7,8hedefleme tasarımını rehberlik için önemlidir. Ancak, tekrarlanan yüksek sıcaklıklara tarama (~ 60-100 ° C) sorunlu olabilir. Örneğin, birçok pharmaceutically önemli bileşikler düzenlenmesi veya yüksek sıcaklık9,10,11, Yanisürekli maruz üzerine ayrışma geçmesi, onlar thermolabile. Etkileşimleri DSC tarafından genellikle bağlama muayene thermogram termodinamik analizler12tekrarlanabilirlik doğrulamak için birden fazla ileriye ve geriye doğru inceden inceye gözden geçirmek gerekir. İlk bir ligand termal dönüşümü değişmiş bağlama özellikleri ile ikincil bir forma yol açar şekil ve art arda gelen yerlerde, konumunu telaffuz farklılıkları sırasında her tarama ile ilk ligand konsantrasyonu azalır bu yana Termal dönüşümü ürünleri birikir. Bu veri kümeleri için geleneksel analizleri mükellef değildir.
Biz son zamanlarda biyomoleküler katlama yöneten ve bağlama etkileşimleri için başvurulan tek bir ligand bağlı deneme termodinamik parametreler komple set verir thermolabile ligand DSC veri kümeleri için küresel uygun yöntem geliştirdik 4ücretsiz biomolecule için gerekli thermogram. Analiz örnek gerektirdiği ve deneysel zamanı azaltır ~ 10 kat standart DSC yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında. Biz muhasebesi ligand için bu varsayarak tarafından termal dönüşümü sırasında her tarama nereye thermogram bağlı değildir ligand konsantrasyonu yüksek sıcaklık bölümü olur. Bu nedenle, ligand konsantrasyonu termodinamik parametreler ayıklamak için kullanılan thermogram bölümünü içinde bir sabittir. Nasıl oranı sabit ligand termal dönüşümü için daha uzun bir yüksek sıcaklık denge süre ile bir ek deneme yaparak elde edilebilir Ayrıca gösterdi. Ligand termal dönüşümü daha az sıcaklık bağımlı nerede sistemleri için (Yani, kayda değer bütün sıcaklıklarda meydana gelen), analiz değişken ligand konsantrasyonu içerecek şekilde değiştirilmiş. Burada biz hızla benzoylecgonine yüksek sıcaklıklarda dönüştürür thermolabile ligand kokain huzurunda DNA aptamer MN4 için bu yordamı göstermek (> 60 ° C). Kinin dönüşüm deneysel bu sıcaklıklarda geçmesi değil ve ayrıca MN4 için bağlar ligand thermolability için bir negatif kontrol kullanılır. Biz thermolabile ligand DSC veri kümeleri ve termodinamik ve Kinetik parametreleri katlama, bağlama ve ligand dönüştürme işlemleri verimli onların analiz edinimi tanımlamak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Değişiklikler ve sorun giderme
Şekil 1 ve Şekil 2 kullanılan küresel uygun analiz ayrıntılarını olmuştur daha önce açıklanan4. Burada, performans ve thermolabile ligandlar ile DSC bağlama deneyler analiz pratik açılardan anahat. Yalnız thermolabile ligand ligand çıkarılır için DSC temel alınan Not + biomolecule dataset, etkili bir şekilde serbest veya termal dönüşüm …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R. W. H. V McGill Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) eğitim programı içinde Bionanomachines tarafından desteklenmiştir. A. K. M., s. E. J. NSERC hibe 327028-09 (A. K. M) ve 238562 (s. E. J.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
Referenzen
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
- Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemie. 29 (29), 6927-6940 (1990).
- Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
- Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
- Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
- Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
- Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
- Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
- Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
- Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemie. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
- Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).
- Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
- Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
- Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemie. 52 (48), 8652-8662 (2013).
- Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
- Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).
