Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type
Summary
Ce protocole décrit la stabilisation du niveau d’oxygène dans un petit volume de tampon recyclé et aspects méthodologiques de la plasticité synaptique activité dépendante d’enregistrement dans des tranches d’hippocampe aiguës immergés.
Abstract
Même si les expériences sur des tranches de cerveau ont été utilisés depuis 1951, problèmes subsistent qui réduisent la probabilité de réaliser une analyse stable et réussie de la modulation de la transmission synaptique lors d’enregistrements intracellulaires ou potentiel sur le terrain. Ce manuscrit décrit des aspects méthodologiques qui peuvent être utiles à l’amélioration des conditions expérimentales pour l’entretien des tranches de cerveau aiguë et d’enregistrement des potentiels postsynaptiques excitateurs de champ dans une chambre de disponible dans le commerce de l’immersion avec une unité de sortie-carbogenation. La sortie-carbogenation aide à stabiliser le niveau d’oxygène dans les expériences qui s’appuient sur le recyclage d’un réservoir tampon petit pour améliorer le rapport coût-efficacité des expériences de la drogue. En outre, le manuscrit présente des expériences représentatives qui examinent les effets de modes différents carbogenation et paradigmes de la stimulation sur l’activité dépendante de la plasticité synaptique de la transmission synaptique.
Introduction
En 1951, les expériences de tranche cérébrale aiguë première signalés étaient menées1. En 1971, après avoir réussi in vitro des enregistrements de piriform cortex2,3 et la découverte que les neurones de l’hippocampe sont interconnectés transversalement le long de l’axe de septotemporal de l’hippocampe4, un de la premiers enregistrements in vitro de l’activité neuronale hippocampique a atteint5. La similitude des paramètres neurophysiologiques ou neurostructural de neurones dans des conditions in vivo et in vitro sont toujours l’objet d’un débat6, mais en 1975, Schwartzkroin7 a indiqué que la basale Propriétés des neurones sont maintenues in vitro et cette stimulation haute fréquence (c.-à-d., tétanisation) des afférents à la formation hippocampique induit une facilitation de longue durée des potentiels synaptiques8. Enregistrement de l’activité neuronale électrophysiologiques in vitro considérablement élargi l’étude des mécanismes cellulaires de la plasticité synaptique activité dépendante9,10, qui avait été découvert en 1973 par Bliss et al. 11 in vivo des expériences avec les lapins.
L’étude de l’activité neuronale ou tranches de cerveau, en particulier dans des tranches d’hippocampe aiguës, les voies de signalisation est maintenant un outil standard. Cependant, étonnamment, des expériences in vitro doivent encore être normalisées, comme en témoignent les multiples approches qui existent encore pour la préparation et l’entretien des tranches d’hippocampe aiguës. Reid et al. (1988) 12 a examiné les défis méthodologiques pour l’entretien des tranches de cerveau aiguë dans différents types de chambres de tranche et les choix de niveau moyen, pH, température et oxygène de baignade. Ces paramètres sont encore difficiles à contrôler dans la chambre d’enregistrement en raison des éléments sur mesure de in vitro tranche-enregistrement des configurations. Publications peuvent être consultées qu’aide à surmonter les défis méthodologiques et qui décrive nouveaux types de chambres de tranche de submersion, comme un interstitiel microperfusion 3D système13, une chambre avec une hotte à flux laminaire et oxygène fournir un système multichambre enregistrement1614et un système de contrôle informatisé température15. Étant donné que ces chambres ne sont pas faciles à construire, la plupart des scientifiques s’appuient sur chambres tranche disponible dans le commerce. Ces chambres peuvent être montés sur un système de microscope, ce qui permet la combinaison d’électrophysiologie et de fluorescence imaging17,18,19. Étant donné que ces chambres de garder les tranches de cerveau immergés dans le liquide céphalorachidien artificiel (aCSF), un débit élevé de la solution tampon doit être maintenue, augmentant les frais de demande de drogue. À cette fin, nous avons incorporé un système de perfusion recyclage avec écoulement-carbogenation qui offre une stabilité suffisante pour l’enregistrement de longue durée des potentiels de champ dans une chambre de tranche de submersion à l’aide d’un volume relativement petit fsca. En outre, nous avons résumé comment l’utilisation de ce système expérimental carbogenation/perfusion affecte le résultat de l’activité-dépendant de la plasticité synaptique10 et comment l’inhibition de l’élongation eucaryote facteur-2 kinase (eEF2K) module synaptique transmission20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que les chambres tranche interface pièce plus robuste réponses synaptiques25,26,27,28, chambres de submersion assurent un confort supplémentaire pour l’enregistrement patch-clamp et fluorescence d’imagerie. Ainsi, nous avons décrit plusieurs aspects d’enregistrements possibles sur le terrain dans des tranches d’hippocampe aiguës en utilisant une chambre de tranche de submersio…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
W.W. menée, analysé et les expériences et a écrit le manuscrit. D.X. et C.P. a aidé à la préparation de la figure et mené les expériences. Ce travail a été soutenu par la FSNC (31320103906) et 111 (B16013) à C.T.
Materials
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi，China | HH-1 | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
Referenzen
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