Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión
Summary
Este protocolo describe la estabilización del nivel de oxígeno en un pequeño volumen de tampón reciclado y aspectos metodológicos de la plasticidad sináptica dependiente de actividad de la grabación en rebanadas hippocampal agudas sumergidas.
Abstract
Aunque los experimentos en rebanadas de cerebro han estado en uso desde 1951, siguen existiendo problemas que reducen la probabilidad de lograr un análisis acertado y estable de la modulación de la transmisión sináptica al realizar grabaciones intracelulares o potenciales del campo. Este manuscrito describe aspectos metodológicos que pueden ser útiles en la mejora de las condiciones experimentales para el mantenimiento de rebanadas cerebrales agudas y para la grabación de potenciales postsinápticos excitatorios de campo en una cámara de inmersión disponibles en el mercado con una unidad de salida carbogenation. La carbogenation de la salida ayuda a estabilizar el nivel de oxígeno en los experimentos que se basan en el reciclaje de un depósito tampón pequeño para mejorar la rentabilidad de experimentos con drogas. Además, el manuscrito presenta experimentos representativos que examinan los efectos de la carbogenation diferentes modos y paradigmas de estimulación de la plasticidad sináptica dependiente de actividad de la transmisión sináptica.
Introduction
En 1951, los experimentos de rebanada cerebral aguda registrados primero fueron realizados1. En 1971, después de éxito en vitro las grabaciones de la corteza piriforme2,3 y el descubrimiento que las neuronas hippocampal están interconectadas transversalmente en el eje septotemporal del hipocampo4, uno de los primeras grabaciones en vitro de la actividad neuronal hippocampal fue alcanzado5. La similitud de los parámetros neurofisiológicos o neurostructural de las neuronas bajo condiciones en vivo y en vitro son todavía objeto de un debate6, pero en 1975, Schwartzkroin7 indica que la basal propiedades de las neuronas se mantienen en vitro y esa estimulación de alta frecuencia (es decir, tetanization) de aferentes en la formación hipocampal induce una facilitación de larga duración de los potenciales sinápticos8. Electrofisiológica de la actividad neuronal en vitro ampliado en gran medida el estudio de los mecanismos celulares de la plasticidad sináptica dependiente de actividad9,10, que había sido descubierto en 1973 por Bliss et al. 11 en vivo experimentos con conejos.
El estudio de la actividad neuronal o la señalización de vías en rebanadas de cerebro y especialmente en rebanadas hippocampal agudas, es ahora una herramienta estándar. Sin embargo, sorprendentemente, en vitro experimentos han estar estandarizados, como lo demuestran los múltiples enfoques que existen para la preparación y mantenimiento de rebanadas hippocampal agudas. Reid et al. (1988) 12 repasa los desafíos metodológicos para el mantenimiento de rebanadas cerebrales agudas en diferentes tipos de cámaras de la rebanada y las opciones de baño nivel medio, pH, temperatura y oxígeno. Estos parámetros son todavía difíciles de controlar en la cámara de grabación debido a los elementos por encargo en vitro rebanada-grabación configuraciones. Pueden encontrar publicaciones que podría ayudar a superar algunos de los retos metodológicos y describen nuevos tipos de cámaras de rebanada de inmersión, como un sistema intersticial microperfusion 3D del13, una cámara con mejor flujo laminar y oxígeno de la fuente14, un sistema con control de temperatura computarizado15y un sistema de grabación multi cámara16. Ya que estas cámaras no son fáciles de construir, mayoría de los científicos se basan en cámaras de corte disponibles en el mercado. Estas cámaras pueden montarse en un sistema de microscopio, permitiendo la combinación de electrofisiología y de fluorescencia de imagen17,18,19. Puesto que estas cámaras guardar las rebanadas de cerebro sumergidas en líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF), un alto flujo de la solución tampón debe mantenerse, aumentar el gasto de uso de la droga. Para ello, hemos incorporado un sistema de perfusión reciclaje con carbogenation de salida que proporciona la estabilidad suficiente para la grabación a largo plazo de los potenciales de campo en una cámara de corte de inmersión usando un volumen relativamente pequeño de la aCSF. Además, resumimos cómo el uso de este sistema experimental carbogenation/perfusión afecta el resultado de la plasticidad sináptica dependiente de actividad10 y cómo la inhibición de la cinasa del factor 2 de elongación eucariotas (eEF2K) modula sináptica transmisión20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque cámaras de rebanada de interfaz exhiben más sólidas respuestas sinápticas25,26,27,28, cámaras de inmersión proporcionan comodidad adicional para la grabación de la abrazadera del remiendo y de la fluorescencia proyección de imagen. Así, hemos descrito algunos aspectos de posibles grabaciones de campo en rebanadas hippocampal agudas usando una cámara de corte de inmersión comer…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
W.W. realizó, analizados y había diseñado los experimentos y escribió el manuscrito. D.X. y C.P. ayudó en la preparación de la figura y llevado a cabo los experimentos. Este trabajo fue apoyado por NSFC (31320103906) y 111 (B16013) en T.B.
Materials
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi，China | HH-1 | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
Referenzen
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