ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

ヒト骨格筋は、筋原性前駆細胞の融合から生じる収縮性多核筋繊維の群からなる。骨格筋は、筋繊維（筋帯）の原形質膜と基底板との間に位置する骨格筋幹細胞であるSCの存在により、損傷後に再生する能力を有する。損傷を受けていない筋肉では、SCはほとんどが静止状態にある。機械的ストレスまたは損傷に応答して、SCが活性化（筋芽細胞）となって増殖し、SCプール^1、2を補充する新しい筋線維または自己複製を形成するために、どちらかの分化を受けます。長年にわたり、SCおよびその子孫、筋芽細胞を骨格筋生検から単離するためのいくつかの技術が開発された。これらの細胞上で発現される細胞表面マーカーおよび蛍光活性化細胞選別（FACS） ^3の方法論のより深い理解により^、4、5、筋肉サンプルからヒト筋芽細胞の純粋な集団を単離することが可能です。

カルシウムシグナリングは、骨格筋の発達、ホメオスタシス、および再生を調節する。特に、SOCEと呼ばれる細胞内貯蔵枯渇後に活性化されるCa ²⁺流入は、これらのプロセスにとって非常に重要である⁶ 。細胞刺激により、エンドソー/筋小胞体（ER / SR）におけるCa ²⁺レベルが減少し、それにより、ER / SR ⁷を補充するためにCa ²⁺流入を可能にする原形質膜Ca ²⁺チャネルが活性化される。 SOCEに関与する2つの主なタンパク質は、ER / SR Ca ²⁺感知間質相互作用分子1（STIM1）タンパク質および原形質膜Ca ²⁺チャネルOrai1である。骨格筋は、これらの2つのタンパク質ならびに同じファミリーの他のタンパク質を豊富に発現する（STIM2 aND ^{Orai2-ORAI3）8,9}及び一過性受容体電位カノニカル（TRPC）ファミリー^{10、11、12、13}のいくつかのCa ²⁺チャネル-permeable。 SOCE経路を通じたCa ²⁺流入は、筋形成/再生¹⁴にとって非常に重要である。 STIM1またはOrai1タンパク質の変異は、筋機能に有害な影響を与え、主に筋緊張低下につながる¹⁵ 。 SOCE障害を有する動物モデルはまた、強化された疲労性^6、16、17と一緒に、減少した筋肉量と力を表示します。前述したように、他のSTIMタンパク質およびOraiタンパク質ならびに多くのTRPCチャネルは、骨格筋において発現され、それらのそれぞれの役割はこれまで決定されていない。ノックすることでdそれらの発現レベルを所有しているので、ヒトの骨格筋分化中のSOCEおよびそれらの役割におけるそれらの影響を調べることが可能である。

SOCE測定は、電気生理学的電流記録およびCa ²⁺測定の2つの異なるアプローチを用いて行うことができる。電気生理学は、関心のある電流およびそれに関連する電気生理学的特徴を測定するので、確かに直接的な方法である。しかしながら、この技術は、主に筋肉細胞のサイズが大きく、内因性SOCE電流が小さいため、筋肉細胞に適用することは非常に困難である。サイトゾルCa ²⁺イメージングは​​技術的に非常にアクセス可能ですが、サイトゾルで測定されたCa ²⁺レベルはCa ²⁺の流入と細胞または内部^貯蔵庫からの再ポンピングの両方を反映するので、測定はより間接的です。

ヒト骨格の小片から筋芽細胞を単離することを含む方法論この論文では、酵素消化、増幅、およびFACS後の筋肉を説明します。時間の経過に伴う分化マーカーの発現に続く筋肉分化および免疫蛍光プロトコールのプロセスが記載されている¹⁸ 。最後に、SOCEの測定およびCa ²⁺シグナル伝達および骨格筋分化における異なるイオンチャネルの役割について説明する。