ההתקדמות האחרונות ביכולת לתמרן גנטית קווי תאים סומטיים להחזיק פוטנציאל גדול עבור מחקר בסיסי ויישומי. כאן, אנו מציגים שתי גישות עבור CRISPR / Cas9 שנוצר נוקאאוט הייצור והקרנה שורות תאים יונקים, עם וללא שימוש סמנים לבחירה.
מערכת ההנדסה הגנטית של CRISPR / Cas9 חוללה מהפכה ביולוגית בכך שהיא מאפשרת עריכה מדויקת של הגנום עם מעט מאמץ. מודרך על ידי מדריך יחיד RNA (sgRNA) המעניק סגוליות, חלבון Cas9 cleaves שני גדילי DNA ב מוקד ממוקדת. ההפצה DNA יכול להפעיל או שאינם הומולוגיים סוף שהצטרף (NHEJ) או הומולוגיה מכוונת לתקן (HDR). NHEJ יכול להציג מחיקות קטנות או הוספות אשר להוביל מוטציות מסגרת משמרת, בעוד HDR מאפשר הפרעות גדול יותר מדויק. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להפקת קווי תא נוקאאוט על ידי צימוד הוקמה CRISPR / Cas9 שיטות עם שתי אפשרויות לבחירה במורד / הקרנה. הגישה NHEJ משתמשת באתר חיתוך יחיד sgRNA ובחירה עצמאית הבחירה, שבו ייצור החלבון מוערכת על ידי אימונובלוט נקודה בצורה תפוקה גבוהה. הגישה HDR משתמש בשני sgRNA לחתוך אתרים כי טווח הגן של עניין. יחד עם תבנית HDR בתנאי, שיטה זו יכולה להשיג מחיקהשל עשרות kb, בסיוע סמן התנגדות לבחירה לבחירה. היישומים והיתרונות המתאימים של כל שיטה נדונים.
שינויים גנטיים יציבים מספקים יתרון על פני שיטות חולפות של הפרעות סלולר, אשר יכול להיות משתנה ביעילות שלהם משך. עריכה גנומית הפכה נפוצה יותר ויותר בשנים האחרונות עקב התפתחות של נוקלאזות ספציפיות למטרה, כגון נוקלאזות של אבץ אצבע , 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , ו RNA מונחה נוקלאזות הנגזרות, מקובצים בקביעות interinded קצר palindromic חוזר (CRISPR) מערכת 10 .
CRISPR / Cas9 מכונות העריכה מותאמת מתוך המערכת החיסונית כי חיידקים ארכאי להשתמש כדי להגן מפני זיהומים ויראלייםהתחת = "xref"> 11 , 12 , 13 . בתהליך זה, קצרים, 20-30 nt שברי רצף ויראלי פולש משולבים לתוך לוקוס גנומי כמו "מרווחים" מוקף יחידות חוזרות 14 , 15 . תעתיק לאחר עיבוד RNA מייצר קטן CRISPR הקשורים RNAs 16 (crRNAs) כי, יחד עם הפעלת crRNA 17 (tracrRNA) מפעיל, להרכיב עם endonuclease Cas9 effector. CRRNAs ובכך לספק ספציפיות למיקוד Cas9, המנחה את המתחם לדבק רצפים דנ"א ויראלי משלימה ומניעת זיהומים נוספים 18 , 19 . כל רצף "protospacer" בדנ"א ממוקד יכול לשמש כמקור של ה- CRRNA, כל עוד הוא ישירות 5 'כדי מוטיב קצר סמוך protospacer (PAM), NGG במקרה של S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. העדר רצף ה- PAM ליד המרווח באזור של ה- CRISPR המארח מבדיל בין העצמי לבין הלא-עצמי, ומנע את המיקוד של המארח. בגלל האוניברסליות והגמישות שלה, מערכת ביולוגית זו הותאמה בעוצמה לעריכה גנומית, כך שכמעט כל אתר דנ"א הצמוד ל- PAM יכול להיות ממוקד. בגרסה זו, שינוי נוסף התמזגו crRNA ו tracrRNA לתוך RNA מדריך יחידה (sgRNA) רכיב נטען לתוך חלבון Cas9 21 .
עם הביטוי של Cas9 ו sgRNA בתאים אוקריוטים, חלבון Cas9 cleaves שני גדילי דנ"א על מוקד ממוקדת. בהיעדר אזור מתאים של רצף הומולוגי, התא מתקן את ההפסקה הזאת באמצעות חיבור לא הומולוגי (NHEJ) 22 , 23 , 24 , אשר בדרך כלל מציג מחיקות קטנות או, לעתים נדירות, כניסות. בעת מיקוד פתוחמסגרת הקריאה, התיקון עלול להוביל frameeshift translational שמייצר מוצר חלבון שאינו פונקציונלי. לעומת זאת, כאשר מסופק עם תבנית אקסוגני עם אזורים גדולים של הומולוגיה, התא יכול לתקן את הפער פעמיים גדיל על ידי הומולוגיה מכוונת לתקן 25 , 26 . נתיב זה מאפשר מחיקות מדויקות יותר, תחליפים או הוספות בגנום, יחד עם הכנסת סמני הבחירה הנבחרים 27 .
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים ליצירת שורות תאים נוקאאוט על ידי אחד משני אלה CRISPR / Cas9 שיטות ( איור 1 א ). הגישה NHEJ משתמשת באתר חיתוך יחיד sgRNA ובחירה עצמאית ההקרנה, ולכן דורש הכנה מראש upfront. בעת שימוש בשיטה זו, מדריך RNAs משלימים אקסונים ליד הקצה 5 'של התמליל, אשר סביר להניח לייצר נוקאאוט, חייב להיות מתוכנן. מאז modificatיונים לגנום במקרה זה הם קטנים, ההקרנה שיבוטים נוקאאוט מבוסס על כתמים נקודה, שבו המוצר חלבון מוערך בצורה תפוקה גבוהה. אנו משתמשים בדוגמה של ELAVL 1 כמו חלבון 1 (ELAVL1). הגישה השנייה מסתמכת על תיקון הומולוגיה מכוונת (HDR) ומשתמשת בשני אתרי חיתוך sgRNA המשתרעים על פני הגן או אזור העניין, ומאפשרים מחיקות של עשרות קילובייט. פלסמיד עם שני אזורים של הומולוגיה כי האגף אתרי מחשוף מספק תבנית תחליף ( איור 1B ), מציגה סמן התנגדות לבחירה כי מגביר את היעילות של הדור נוקאאוט. שיטה זו יכולה גם להיות מותאם כדי להציג שינויים גנים עם זרועות הומולוגיה מתוכנן כראוי. במקרה זה, שילוב של קטע DNA חדש מאפשר סינון מבוסס PCR ( איור 1C ). כאן, אנו משתמשים הדור של Pumilio RNA מחייב בן משפחה 2 (PUM2) נוקאוט שורות כדוגמה.
מערכת CRISPR / Cas9 אפשרה ייצור יעיל של שינויים גנומיים יציבים, המספקים חלופה עקבית יותר לשיטות מניפולציה אחרות. הנה, הצגנו שתי שיטות לזיהוי מהיר של CRISPR / Cas9 גן knockouts בקווים תא יונקים. שתי השיטות דורשות חומר סלולרי קטן, ולכן הבדיקה יכולה להתבצע בשלבים המוקדמים של התרבות המשו…
The authors have nothing to disclose.
המחברים היו רוצים להודות Gissell Sanchez, מייגן לי, וג 'ייסון Estep לסיוע ניסיוני, וייפנג גו ו Xuemei חן על שיתוף ריאגנטים.
Competent E. coli cells | |||
plasmid prep kit | |||
pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
Toothpicks | bacterial PCR | ||
Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
HEK293 human cells | |||
DMEM | Corning | 10-013-CV | |
FBS | Corning | MT35010CV | |
Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
6 well plates | BioLite | 12556004 | |
TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
TBST | recipe decribed in protocol | ||
Dehydrated milk | |||
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
KOD polymerase | Novagen | 71316 |