Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

Alterações genéticas estáveis ​​oferecem uma vantagem sobre os métodos transitórios de perturbação celular, que podem ser variáveis ​​em sua eficiência e duração. A edição genômica tornou-se cada vez mais comum nos últimos anos devido ao desenvolvimento de nucleases específicas do alvo, como as nucleases de zinco-dedo ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} , as nucleases efetoras do tipo ativador da transcrição (TALENs) ^{6 , 7 , 8 , 9} E nucleases guiadas por RNA derivadas do sistema de repetições palindrômicas curtas agrupadas, regularmente intercaladas (CRISPR) ¹⁰ .

A maquinaria de edição CRISPR / Cas9 é adaptada de um sistema imunológico que bactérias e archaea usam para se defender contra infecções viraisAss = "xref"> 11 ^{, 12 , 13} . Neste processo, fragmentos curtos de 20-30 nt de sequência viral invasora são incorporados em um locus genômico como "espaçadores" flanqueados por unidades repetitivas ^{14 , 15} . A transcrição subsequente e o processamento de RNA geram pequenos RNAs ¹⁶ (CRRNAs) associados ao CRISPR que, juntamente com um CRRNA ¹⁷ (traRRNA) trans-ativador, se reúnem com a endonuclease efectora Cas9. Os crRNAs proporcionam assim especificidade ao alvo de Cas9, guiando o complexo para separar sequências de DNA viral complementares e prevenir novas infecções ^{18 , 19} . Qualquer sequência de "protospacer" no DNA alvo pode servir como fonte do crRNA, desde que seja diretamente 5 'para um motivo adjacente prótespacer curto (PAM), NGG no caso de S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. A ausência da sequência PAM perto do espaçador no locus CRISPR do host distingue-se de si mesmo e não-auto, evitando a segmentação do hospedeiro. Devido à sua universalidade e flexibilidade, este sistema biológico foi poderosamente adaptado para a edição genômica, de modo que quase qualquer site de DNA adjacente ao PAM pode ser direcionado. Nesta versão, uma modificação adicional fundiu o crRNA e o tracrRNA em um único componente guia RNA (sgRNA) que é carregado na proteína Cas9 ²¹ .

Após a expressão de Cas9 e um sgRNA em células eucarióticas, a proteína Cas9 corta as duas cadeias de DNA no locus alvo. Na ausência de uma região adequada de sequência homóloga, a célula corrige esta ruptura através de união final não homóloga (NHEJ) ^{22 , 23 , 24} , que tipicamente introduz pequenas deleções ou, raramente, inserções. Ao segmentar umQuadro de leitura, o reparo provavelmente leva a um quadro de translação que produz um produto proteico não funcional. Em contraste, quando fornecido com um modelo exógeno com grandes regiões de homologia, a célula pode corrigir a ruptura de duas vertentes por reparo direcionado por homologia ^{25 , 26} . Esta rota permite exclusões, substituições ou inserções precisas maiores no genoma, juntamente com a introdução de marcadores de seleção excisáveis ²⁷ .

Aqui, apresentamos protocolos para gerar linhas celulares knockout por qualquer um desses dois métodos CRISPR / Cas9 ( Figura 1A ). A abordagem do NHEJ usa um único site de corte de sgRNA e rastreio independente de seleção e, portanto, requer pouca preparação antecipada. Ao usar este método, os RNAs de guia complementares aos exons próximos ao final 5 'da transcrição, que são mais propensos a produzir um knockout, devem ser projetados. Desde o modificatOs íons para o genoma neste caso são pequenos, a triagem para clones knockout baseia-se em manchas de ponto, onde o produto proteico é avaliado de forma eficiente. Utilizamos a geração de linhas knockout de proteína ELAV-like 1 (ELAVL1) como exemplo. A segunda abordagem baseia-se na reparação direta de homologia (HDR) e usa dois sites de corte de sgRNA que abrangem o gene ou região de interesse, permitindo deleções de dezenas de kb. Um plasmídeo com duas regiões de homologia que flanqueiam os sites de clivagem fornece um modelo de substituição ( Figura 1B ), introduzindo um marcador de resistência selecionável que aumenta a eficiência da geração de nocaute. Este método também pode ser adaptado para introduzir modificações de genes com armas de homologia devidamente projetadas. Neste caso, a integração de um novo fragmento de DNA permite a triagem baseada em PCR ( Figura 1C ). Aqui, usamos a geração de linhas knockout do membro da família Pumilio RNA vinculativo 2 (PUM2) como exemplo.