Summary

생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합

Published: August 28, 2017
doi:

Summary

초기 endosome 함수 F 말라 합에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 설명 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 반응의 복잡 한 시리즈가 생화학 및 유전 의무가 렌더링 조작입니다.

Abstract

많은 초기 endosome 기능, 특히 화물 단백질 정렬 및 막 변형, endosomal 막에 nucleated 짧은 F 걸 필 라 멘 트의 따라 달라 집니다. 우리는 설립 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 의무가 유전 그리고 생 화 확 적인 반응의이 복잡 한 시리즈를 렌더링 조작입니다. Endosomal 분수 부양 초기 endosomal 단백질 GFP RAB5을 표현 하는 세포에서 자당 기온 변화도에 의해 준비 된다. Cytosolic 분수 셀의 별도 일괄 처리에서 준비 된다. Endosomal와 cytosolic 분수 저장할 수 있습니다 액체 질소에서 냉동 필요한 경우. 분석 결과, endosomal와 cytosolic 분수, 혼합 한 혼합물은 적절 한 조건 (예를 들어, 이온 강도, 감소 환경)에서 37 ° C에서 알을 품을. 원하는 시간에 반응 혼합물을 고정 하 고 F 걸 phalloidin로 드러났습니다. 말라 nucleation와 중 합 후 형광 현미경 검사 법에 의해 분석 된다. 여기, 우리는이 분석 결과 말라 nucleation 막, 또는 후속 신장, 분기, 또는 F 걸 필 라 멘 트의 가교에 관련 된 요인의 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다 보고 합니다.

Introduction

높은 진 핵 세포, 단백질 및 지질 초기 endosomes 정렬이 발생 하는 위치에 내 면 됩니다. 일부 단백질과 지질, reutilized 될 운명, 초기 endosomes의 관 지역에 통합은 그리고 그 때 수송 된다 원형질 막 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN)1,2. 대조적으로, 다른 단백질과 지질 선택적으로 multivesicular 모양을 전시 초기 endosomes의 지역에 포장 됩니다. 이 지역 확장 하 고, 초기 endosomal 막에서 분리, 시 무료 endosomal 캐리어 소포 또는 multivesicular 시체 (ECV/MVBs), 결국 성숙한는 늦은 endosomes1, 으로 화물 운송에 대 한 책임 2.

말라는 endosomal 정렬 용량과 endosome 속과 관련 된 막 개장 과정에서 중요 한 역할을 한다. 원형질 막 또는 TGN 재활용 경로 따라 정렬 단백질 복잡 한 retromer와 관련 된 단백질에 따라 달라 집니다. 이 정렬 기계 재활용 tubules 통해 상호 작용의 복잡 한, retromer의 말 벌 및 흉터 homologue (세척) 복잡 하 고 분기 말라3,4,5 형성에 결합 될 것 . 반면, 분자 저하에 대 한 운명, 특히 신호 수용 체 활성화, endosomal 단지 전송 (ESCRT)2,6,에 필요한 정렬 정렬할 intraluminal 소포 (ILVs)으로 7. ESCRT-종속 정렬 과정에서 말라의 가능한 역할을 알 수 없습니다 하는 동안 F-걸 ECV/MVBs의 속에 그리고 이른 endosomes 넘어 전송에 중요 한 역할을 재생 합니다. 특히, 우리 콜레스테롤 풍부한 지역 초기 endosome의 spire1 함께 바인딩합니다 annexin A2, F-말라 합 nucleates 발견. Endosomes에서 분기 말라 네트워크의 형성 필요 걸 관련 단백질 (ARP) 2/3의 분기 활동, 복합 음 단백질 moesin 고 말라-바인딩 단백질 cortactin8,9.

여기, 우리가 시험관에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 시험관에서 이른 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 설명 합니다. 이 분석 결과 이전 F-말라 nucleation에서 A2 annexin의 moesin 및 cortactin endosomal 걸 네트워크8,9의 형성에의 역할을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 이 생체 외에서 프로토콜 말라 합 동안 endosomes에 발생 하는 반응의 복잡 한 시리즈 될 걸 nucleation, 선형을 포함 하 여 과정의 순차적 단계의 생 화 학적 및 분자 분석에 순종 중 합, 분기, 고 가교입니다.

Protocol

1. 솔루션 및 참고: 모든 버퍼 및 솔루션 이중 증 류 (dd) H 2 o.에에서 준비 되어야 한다 자당의 수 분 상태가 다르기 때문에 모든 자당 솔루션의 최종 농도 결정 되어야 합니다은 굴절 계를 사용 하 여. Divalent 양이온 (PBS-) 없이 준비 인산 염 버퍼 염 분: 137 m NaCI m, 2.7 m KCl m, 1.5 m m KH 2 포 4 및 6.5 m m 나 2 HPO 4. PH 7.4에 조정 합니다. 압…

Representative Results

초기 endosome 막에 F 걸 패치의 형성에 대 한 통찰력을 얻으려면, 우리 그림 2에 설명 된 프로토콜을 따 랐 다. 간단히, 셀 GFP RAB5와 페 했다 고 초기 endosomes subcellular 분류에 의해 준비 되었다. 이러한 정화 초기 endosomes 자체 뿐만 아니라 다른 요인 가능성이 반응에 관련 된 걸 수 있도록 cytosol와 인 큐베이 팅 했다. 잠복기의 끝에, 반응 혼합물의 고정에 ?…

Discussion

말라는 endosome 막 역학4,14에서 중요 한 역할을 한다. 우리 이전 보고 말라 nucleation 및 중 합 초기 endosomes에 발생 작은 F 걸 패치 또는 네트워크 형성. 이러한 F-말라 네트워크는 초기 endosomes 저하 통로 넘어 막 전송 절대적으로 필요 합니다. 이 nucleation 및 중 합 프로세스의 어떤 단계에서 방해 endosome 성숙 및 따라서 늦은 endosomes andlysosomes9

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

스위스 국립 과학 재단;에서 지원 받은 스위스 Sinergia 프로그램; 폴란드어-스위스 연구 프로그램 (PSPB-094/2010); 화학 생물학; NCCR 그리고 스위스 SystemsX.ch 이니셔티브에서 LipidX (J. G.)에 스위스 국립 과학 재단에 의해 평가. O. M. EMBO 장기 친교 (ALTF-516-2012)에 의해 지원 되었다.

Materials

NaCl Sigma-Aldrich 71380
KCl Acros Organics 196770010
KH2PO4 AppliChem A1042
Na2HPO4 Acros Organics 424370025
Hepes AppliChem A3724
Magnesiun acetate tetrahydrate Fluka 63047
Dithiothreitol (DTT) AppliChem A2948
Imidazole Sigma-Aldrich 10125
NaOH Fluka 71690
Sucrose Merck Millipore 107687
Leupeptin Roche 11017101001
Pepstatin Roche 10253286001
Aprotinin Roche 10236624001
Paraformaldehide Polysciences. Inc 380
Alexa Fluor 555 phalloidin Molecular Probes A34055
Actin rhodamine Cytoskeleton. Inc APHR-A
Mowiol 4-88 Sigma-Aldrich 81381 poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 
DABCO Sigma-Aldrich D-2522
Tris-HCl AppliChem A1086
β-casein Sigma-Aldrich C6905
Filter 0.22um Millex  SL6V033RS
Round 10cm dishes for cell culture Thermo Fisher Scientific 150350
Plastic Pasteur pipette Assistent 569/3 40569003
15-ml polypropylen tube  TPP 91015
Hypodermic Needle 22G Black 30mm  BD Microlance 300900
Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle BD Plastipak 300013
Micro glass slides  Assistent 2406
18X18-mm glass coverslip Assistent 1000/1818
SW60 centrifuge tube Beckman coulter 344062
TLS-55 centrifuge tube Beckman coulter 343778
200-μl yellow tip Starlab S1111-0706
1000-μl Blue Graduated Tip Starlab S1111-6801
1.5-ml test tube Axygen MCT-175-C 311-04-051
18-mm diameter round coverslip  Assistent 1001/18
35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm)  In vitro Scientific D35-20-1.5-N
Refractometer Carl Zeiss 79729
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Sorvall WX80 Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific 46900
Tabletop ultracentrifuge Beckman coulter TL-100
SW60 rotor Beckman coulter 335649
TLS-55 rotor Beckman coulter 346936
Confocal microscopy Carl Zeiss LSM-780
Fugene HD transfection reagent Promega E2311
Protein assay reagent A Bio-Rad 500-0113
Protein assay reagent B Bio-Rad 500-0114
Protein assay reagent S Bio-Rad 500-0115
Cell scraper Homemade Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps
Refractometer Carl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Sigma-Aldrich M0643
FCS Thermo Fisher Scientific 10270-106
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Thermo Fisher Scientific 11140-035
L-Glutamine  Thermo Fisher Scientific 25030-024
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
pH Meter 691 Metrohm
ImageJ software NIH, Bethesda MD

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Muriel, O., Scott, C. C., Larios, J., Mercier, V., Gruenberg, J. In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes. J. Vis. Exp. (126), e55829, doi:10.3791/55829 (2017).

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