In Vitro Polymerisatie van F-actine op vroege Endosomen
Summary
Vroege endosome functies is afhankelijk van F-actine polymerisatie. Hier beschrijven we een microscopie gebaseerde in vitro -assay die reconstitutes de nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege endosomal membranen in proefbuizen, waardoor deze complexe reeks reacties vatbaar voor biochemische en genetische manipulaties.
Abstract
Vele vroege endosome functies, met name lading eiwit sorteren en membraan vervorming, afhankelijk van de patches van korte F-actine-filamenten nucleated op het endosomal-membraan. Wij hebben vastgesteld een microscopie gebaseerde in vitro -assay die reconstitutes de nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege endosomal membranen in proefbuizen, waardoor deze complexe reeks reacties vatbaar voor genetische en biochemische manipulaties. Endosomal breuken worden voorbereid door floating in sacharose verlopen uit cellen uiten van de vroege endosomal eiwit GFP-RAB5. Cytosolische breuken zijn bereid uit afzonderlijke batches van cellen. Zowel endosomal als cytosolische breuken kunnen worden opgeslagen bevroren in vloeibare stikstof, indien nodig. In de test, de endosomal en cytosolische fracties worden gemengd en het mengsel is geïncubeerd bij 37 ° C onder passende omstandigheden (bijvoorbeeld Ionische sterkte, vermindering van milieu). Op het gewenste tijdstip, het reactiemengsel is vast, en de F-actine wordt onthuld met phalloidin. Actin nucleatie en polymerisatie worden vervolgens geanalyseerd door fluorescentie microscopie. Wij rapporteren hier dat deze bepaling kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de rol van factoren die betrokken zijn, hetzij in actine nucleatie op het membraan, of in de daaropvolgende rek, vertakking, crosslinking van F-actine-filamenten.
Introduction
In hogere eukaryote cellen, zijn eiwitten en lipiden geïnternaliseerd in vroege Endosomen waar sorteren plaatsvindt. Sommige eiwitten en lipiden, die zijn bestemd om te worden reutilized, zijn opgenomen in de tubulaire regio’s van de vroege Endosomen en vervolgens naar het plasma-membraan of de trans-Golgi network (TGN)1,2vervoerd. Andere eiwitten en lipiden zijn daarentegen selectief verpakt in regio’s van de vroege Endosomen die een multivesicular uitstraling vertonen. Deze regio’s uit te breiden en, op onthechting van vroege endosomal membranen, uiteindelijk volwassen in gratis endosomal vervoerder blaasjes of multivesicular organen (ECV/MVBs), die verantwoordelijk zijn voor vracht naar de late Endosomen1, 2.
Actin speelt een cruciale rol in het membraan remodelleert proces endosomal Sorteer capaciteit en endosome biogenese is gekoppeld. Eiwit sorteren langs de recycling trajecten aan het plasma-membraan of de TGN hangt af van de complexe retromer en de bijbehorende eiwitten. Deze Sorteer machine lijkt te worden gekoppeld aan de vorming van de recycling tubuli via interacties van de retromer complex, met WASP en litteken homologe (WASH) complexe en vertakt actine3,4,5 . Daarentegen moleculen bestemd voor afbraak, met name geactiveerd signalering receptoren, zijn ingedeeld in intraluminale blaasjes (ILVs) door de endosomal complexen vereist voor vervoer (ESCRT)2,6, sorteren 7. Terwijl de mogelijke rol van actine in de ESCRT-afhankelijke sorteren proces is niet bekend, speelt F-actine een belangrijke rol in de biogenese van ECV/MVBs en vervoer buiten de vroege Endosomen. Bovenal vonden wij dat Annexine A2 bindt cholesterol-verrijkt gebieden van vroege endosome, en samen met spire1, nucleëert F-actine polymerisatie. De vorming van het netwerk van de vertakte actine waargenomen op Endosomen vereist de vertakkende activiteit van de actine-gerelateerde eiwitten (ARP) 2/3 complex, evenals de ERM eiwit moesin en de actine-bindende eiwit cortactin8,9.
Hier beschrijven we een microscopie gebaseerde in vitro -assay die reconstitutes de nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege endosomal membranen in proefbuizen. Deze test is eerder gebruikt voor het onderzoeken van de rol van de Annexine A2 in F-actine nucleatie en moesin en cortactin in de vorming van endosomal actine netwerken8,9. Met dit protocol in vitro , de complexe reeks reacties die op Endosomen tijdens de actine polymerisatie optreden worden vatbaar voor de biochemische en moleculaire analyse van de opeenvolgende stappen van het proces, met inbegrip van actine nucleatie, lineaire polymerisatie, vertakking en crosslinking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Actin speelt een cruciale rol in de endosome membraan dynamics4,14. Eerder meldden wij dat actine nucleatie en polymerisatie optreden op vroege Endosomen, vormen kleine F-actine patches of netwerken. Deze F-actine-netwerken zijn absoluut nodig voor Membraantransport buiten vroege Endosomen langs het traject van de afbraak. Mengen bij elke stap van dit proces nucleatie en polymerisatie voorkomt rijping van de endosome en dus stroomafwaarts vervoer naar laat Endoso…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Steun was ontvangen van de Zwitserse nationale Stichting voor Wetenschappen; het Zwitserse Sinergia-programma; de Pools-Zwitsers onderzoeksprogramma (PSPB-094/2010); het NCCR in de chemische biologie; en LipidX van het initiatief van de Zwitserse SystemsX.ch, beoordeeld door de Zwitserse National Science Foundation (met J. G.). O. M. werd gesteund door een EMBO op lange termijn fellowship (ALTF-516-2012).
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22um | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-ml polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18X18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μl yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1000-μl Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-ml test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
Referenzen
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up!. Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
