确定癌细胞使用肿瘤治疗领域的最佳抑制频率（TTFields）

1. TTFields 体外应用系统-底板和Dish维护冲洗流动的自来水下菜和菜盖。然后用去离子水和风干面朝下冲洗。 如果化疗剂/药物已被添加到培养皿中事先的实验，填充用5％的光洗涤剂溶液各培养皿并留下过夜。 彻底冲洗流动的自来水下避免培养皿内的洗涤剂的任何痕迹的菜肴。冲洗菜肴和菜肴用去离子水和风干面朝下覆盖。 将干净且干燥的菜肴，其覆盖到杀菌袋。密封和放置行李在高压釜中，用菜朝下。高压釜30分钟，在不超过121℃高。 将反应釜上的干燥程序，部分打开高压釜门，擦盘子30分钟。 擦拭用70％乙醇轻轻浸湿的布在底板上。 </醇> 2.实验设置注意：在这个协议中使用的所有的设备和材料在材料清单中有描述。所有下面的步骤应在层流柜内，同时保持无菌条件下进行。 制备清洁和无菌TTFields菜肴和盖，如部分1中所描述擦拭底板与用70％乙醇轻轻润湿的布。 通过按下轻轻放在培养皿中并通过约5mm，直至盘锁的轮辋上在底板的三个销顺时针旋转安装TTFields菜肴盖到基板。放置一个无菌的22毫米的盖玻片（处理过的塑料或玻璃）上的每个培养皿的底部。 准备在完全生长培养基（细胞悬浮液的Dulbecco改良的Eagle为U型87 MG和F98培养基; RPMI为A2780和OVCAR-3;如上述补充 材料清单）。 注：CEll浓度取决于细胞类型和实验持续时间，实验结束时不应超过80％-90％汇合的细胞生长。 注意：人体细胞系可能代表生物危害，应以适当的安全措施处理。 将200μL细胞悬浮液（通常在200μL中为200μL，在72小时实验中取决于倍增时间），作为每个盖玻片中心的下降并用盖盖覆盖。 在CO 2培养箱中37℃孵育，直至细胞粘附;在这个阶段可以过夜孵化。 使用200或1,000μL移液管从液滴中吸出液体。 轻轻移液2 mL完全生长培养基，以填补每一道菜。使用无菌尖端吸移并轻轻敲击盖玻片边缘，以释放偶尔被夹在滑块下面的气泡。 用盖子盖上碗碟，放在里面IDE在37℃的CO 2培养箱直到TTFields治疗的开始。 3. TTFields应用传送与附加TTFields菜底板到冷藏CO 2培养箱中培养。 注意： 在体外 TTFields应用会产生热量;因此，冷藏培养箱需要补偿的餐具的变暖。更高TTFields强度会产生更多的热量，将需要较低的培养箱环境温度（ 见表1）。当培养箱温度TTFields应用是在18-30℃的范围内的临床相关TTFields强度来实现的。 扁平电缆母连接器连接到所述底板。接通TTFields发电机。 启动体外应用系统软件的TTFields和选择实验设置。 定义一个新的实验。键入exp的名字eriment并在计算机屏幕上的软件用户界面的实验所有者。调整为每道菜或底板上的频率和目标温度。 开始使用该软件的应用TTFields。 验证所有菜肴都正确连接，并且显示屏上出现淡蓝色。如果一个菜是用红色框圈（意思是说没有正确连接），轻轻按下了下去，慢慢地来回转动，直到触点恢复，盘中出现淡蓝色。 发表长达24小时运行在体外应用系统的TTFields。 如果实验达到终点，通过点击该软件的最终试验按钮停止实验并继续执行步骤5.如果不是，请点击暂停试验。 断开底板的扁平电缆连接器。删除与从培养箱餐具的底板成层流柜。 在所有的菜更换介质ES每24小时和基板返回到冷藏培养箱中。底板连接到使用扁平电缆的发电机。通过点击Continue按钮继续实验。 4.控制样品 注：生长控制的细胞中相似的条件TTFields处理的细胞，不含TTFields应用。 板的对照样品具有相同的悬浮液，并在用于电镀TTFields处理的样品类似的表面。 放置控制菜在CO 2培养箱中在37℃。 替换在餐具的介质每24小时以匹配TTFields处理的培养皿中的条件。 5.实验结束点击结束实验后，等待该软件从系统中检索的所有记录，并记录保存到计算机。 使用报表按钮查看温度，电流和电阻日志˚F每个基板，以验证所有的菜均按照实验计划进行处理。 注意：实验结束后，所有报告和日志将保存到计算机，并可随时进行检查。 关闭TTFields生成器。 断开扁平电缆与基板的连接，并从培养箱中取出。 要取下陶瓷盘，请按下并逆时针转盘，将其从基板上解锁。 将菜肴放入层流柜中，无菌取出盖玻片。将其转移到含有新鲜培养基或磷酸盐缓冲盐水（PBS）的无菌培养皿中进一步检查和评价。 评估TTFields的效果注意：TTFields的效果可以通过几种方式确定。使用一种或多种以下方法将处理的细胞与未处理的对照细胞进行比较： 细胞计数从每个包含盖玻片培养皿中取出培养基/ PBS。 0.5mL的0.25％胰蛋白酶/ EDTA加入各培养皿并孵育至多10分钟（ 即，直到细胞开始从盖玻片表面脱离）在37℃下在CO 2培养箱中培养。 加入0.5毫升的完全生长培养基中和胰蛋白酶，并通过向下轻轻吹打并重新悬浮细胞。 计数使用任何标准细胞计数技术，该技术是具有低细胞浓度计数兼容的细胞（ 即，大约20,000细胞/ mL）。 克隆分析板从每个皿到新的无菌皮氏培养皿或含有2毫升的新鲜完全生长培养基的6孔板中的细胞相似的数目（每皿100-500细胞）。 孵育在CO 2培养箱中在37℃下进行1-3周（取决于各细胞系的性质），直到由〜50个形成细胞的集落。评估细胞通过光学显微镜每集落数。 除去培养基并用PBS冲洗。 除去PBS并加入冰冷的甲醇（1mL）中。孵育在-20℃下10分钟或更长的时间。 除去甲醇。 添加结晶紫溶液（0.1％w / v的在水中的25％V / V甲醇）并孵育20分钟。 注意：水晶紫是一个潜在的致癌物质;使用手套，用结晶紫工作时。 除去结晶紫，用去离子水洗涤3次，并风干。 计数形成在每个培养皿的菌落。