Een protocol voor de uitgebreide extractie van lipiden, metabolieten en eiwitten uit biologische weefsels met behulp van een monster wordt gepresenteerd.
Begrip van complexe biologische systemen vereist de meting, analyse en integratie van meerdere samengestelde klassen van de levende cel, gewoonlijk bepaald door transcriptomische, proteomische, metabolomische en lipidomische metingen. In dit protocol introduceren we een eenvoudige methode voor de reproduceerbare extractie van metabolieten, lipiden en eiwitten uit biologische weefsels met een enkele hoeveelheid per monster. De extractiemethode is gebaseerd op een methyl tert -butylether: methanol: water systeem voor vloeistof: vloeibare verdeling van hydrofobe en polaire metabolieten in twee niet-mengbare fasen, samen met de precipitatie van eiwitten en andere macromoleculen als een vaste pellet. Deze methode levert derhalve drie verschillende fracties van specifieke moleculaire samenstelling, die volledig compatibel zijn met gemeenschappelijke omics-technologieën zoals vloeibare chromatografie (GC) of gaschromatografie (GC) gekoppeld aan massaspectrometers. Hoewel de methode init wasIally ontwikkeld voor de analyse van verschillende plantweefselmonsters, het is gebleken volledig verenigbaar te zijn voor de extractie en analyse van biologische monsters uit systemen die zo divers zijn als algen, insecten en zoogdierweefsels en celculturen.
Systembiologie, die zich in het midden van de vorige eeuw 1 tot stand kwam en werd geavanceerd door de grote schaalanalyse van genomische en transcriptomische datasets 2 , 3 , is ontwikkeld tot een nieuwe en onontbeerlijke aanpak voor de analyse van complexe biologische systemen 4 , 5 . Het hoofddoel van systeembiologie is om de componentinteracties en afhankelijkheden in biologische systemen te ontcijferen en de link tussen genotypes, hun realisatie, moleculaire transformaties en resulterende fenotypes te overbruggen. Bijgevolg is de integratie van uitgebreide datasets, geproduceerd door de verschillende grootschalige analytische benaderingen, namelijk genomics, transcriptomics, metabolomics, lipidomics en proteomics en hun berekeningsanalyse, een voorwaarde gekregen voor de beschrijving en het begrip van complexe biologische systemen.
Bas Uit de enorme chemische diversiteit en complexiteit van biologische componenten in elk levend systeem is de productie van grote en uitgebreide 'omics'-datasets sterk afhankelijk van de kwaliteit van de toegepaste extractiemethode 9 . Naast de kwaliteit van de extractiemethode is de economie van de methode belangrijk; Dit betekent dat het wenselijk zou zijn om zoveel moleculaire informatie te verkrijgen van zo weinig mogelijk sample-invoer. Vaak kunnen monsterhoeveelheden worden beperkt en daarom is het zeer wenselijk om gebruik te maken van een extractiemethode, die zo veel moleculaire klassen kan afleiden uit een enkele extractie van een gegeven monster. Dit betekent dat in plaats van meerdere gespecialiseerde extractiemethoden te gebruiken voor de extractie van verschillende samengestelde klassen uit verschillende monsters van hetzelfde monster van hetzelfde monster, wordt een sequentiële extractiemethode toegepast die de moleculaire bestanddelen van een enkele aliquot fractioneert in verschillende moleculaire fracties.
_content "> De gebruikelijke methode die toegepast wordt voor deze gefractieerde extractiemethoden is gebaseerd op de twee-fase lipidextractiewerkwijze van Folch et al., Ontwikkeld in 1957 10. Deze methode is gebaseerd op een chloroform: methanol / waterverdeling van polaire en hydrofobe metabolieten en was Bestemd voor het opruimen en ontcomplexen van monsters voor hoge kwaliteit lipide analyse. Met de evolutie van multi-omics systemen biologie werd de Folch methode verder, stapwijdig, verbeterd door het te gebruiken voor de monstersepartitie van eiwitten en polaire metabolieten en lipiden voor Gas- en vloeistofchromatografie gebaseerde metabolomics en lipidomics van polaire en hydrofobe verbindingen, naast proteïnes op basis van vloeistofchromatografie 11 , 12 , 13 , 14. Helaas zijn alle methoden gebaseerd op een extractiemethode op chloroform die niet alleen Leidt tot de ongewenste foRmatie van de eiwitpellet als een interfase tussen de polaire en lipidefase, maar die ook een ongewenst oplosmiddel uit een groen chemieperspectief 15 , 16 is . Echter, het oplosmiddel methyl tert -butylether (MTBE) overwint beide van deze bovengenoemde problemen en is een geschikte vervanging voor chloroform. Op basis van deze eisen hebben we besloten om een MTBE: methanol: water-extractiemethode op te stellen die voldoet aan alle voornoemde specificaties en daarom fungeert als een ideaal uitgangspunt voor uitgebreide multi-omics analyse 16 .Dit protocol leidt de gebruiker stap voor stap door middel van de eenvoudige, snelle en reproduceerbare werkstroom van het monstervoorbereiding, inclusief het oplossen van problemen die doorgaans waargenomen worden. Verder zullen we kortom voorbeeldige analytische gegevens introduceren van ultra-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (UPLC-MS) -basEd lipidomics, metabolomics en proteomics profileren van plantweefselmonsters. Hoewel de gegeven voorbeelden afkomstig zijn van 50 mg van een Arabidopsis thaliana bladweefselmonster , is dit protocol gebruikt voor verscheidene andere biologische monsters en weefsels, waaronder algen 17 , 18 , insecten 19 en zoogdiercellen, organen en weefsels 20 , 21 , 22 . De reikwijdte van het gepresenteerde extractieprotocol is om een duidelijke en gedetailleerde omschrijving te geven van de pre-extractie-monsterbehandeling en de extractieprocedure zelf. Hoewel we drie korte voorbeelden van analytische applicatie geven, kunnen gedetailleerde informatie over de pre- en postanalyse-gegevensverwerking worden verkregen uit onze eerdere publicaties 16 , 23 , 24 , <supClass = "xref"> 25 , 26 .
In dit artikel beschrijven en illustreren we een eenvoudig en zeer toepasbaar extractieprotocol voor een uitgebreide lipidomische, metabolomische en proteomische analyse uit een enkelvoudig 50 mg bladmonster. De methode is eerder gebruikt in verschillende studies, die zijn gepubliceerd in diverse artikelen 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 En bewezen, naast zijn straight-forwardWorkflow en high applicability zijn robuust en reproduceerbaar.
De hier verstrekte toepassingen tonen een aantal routine methodes voor de initiële screening van een complex biologisch monster. Deze geïllustreerde grootschalige metabolomische en lipidomische datasets kunnen uitgebreide informatie geven over de brede of specifieke veranderingen in het metabolisme van het geanalyseerde biologische systeem, terwijl de gegevens verkregen uit de analyse van eiwitten inzicht geven in kwantitatieve (overvloed) en kwalitatieve (modificaties ) Veranderingen van enzymen, structurele eiwitten of transcriptiefactoren (TF's) die de cellulaire functies en machines regelen. Derhalve heeft integratieve omics-gegevens het potentieel om initiële informatie te onthullen over mogelijke veranderingen geïnduceerd door genetische of biotische en / of abiotische verstoringen van een biologisch systeem, door moleculaire veranderingen van diverse moleculen geassocieerd met specifieke metabolische pathways of cellulaire processen toe te lichten.
NatuurlijkOp het lange termijn is het voor een succesvolle systeembiologieanalyse redelijk essentieel om het aantal geanalyseerde en geannoteerde moleculaire entiteiten te maximaliseren, waardoor de monitoring van cellulaire functies en activiteiten zo volledig mogelijk is. Voor dit doel kunnen de verkregen fracties additioneel toegepast worden op diverse analytische werkwijzen, die verdere verbindingen of samengestelde klassen richten ( Figuur 4 ).
Dit gezegd hebbende moet worden vermeld dat de globale analysestrategie van de verkregen data kan worden gevolgd door twee verschillende strategieën: aan de ene kant benadrukken we de opheldering van cellulaire functies door kwantificering van bekende verbindingen. Aan de andere kant zijn veel van de gemeten metabolieten en lipiden nog niet bekend of geannoteerd. Deze, maar niet-geannoteerde samengestelde metingen bevatten ook veel zinvolle informatie, die kan worden gebruikt door statistische methoden voor classificatie of discriminatie bTussen groepen of behandelingen 20 , 21 , 22 .
Toch moeten deze onbekende verbindingen, vooral die welke relevant zijn voor de indeling of de dienstverlening als biomarkers, worden geïdentificeerd. Dit identificatieproces is helaas nogal vervelend en kan niet worden bereikt zonder aanvullende analytische metingen of strategieën 38 . Zoals blijkt uit figuur 4 is het aantal niet-geannoteerde verbindingen vrij hoog (eigenlijk de overgrote meerderheid). Niettemin, zoals hierboven vermeld, kunnen deze chromatografische pieken worden behandeld binnen de data-analyse en daarom kunnen significante getroffen entiteiten worden toegelicht en onderworpen aan verdere identificatie strategieën.
Samenvattend kunnen we concluderen dat het hierin ingevoerde protocol voorziet in verschillende voordelen voor de experimentele systeembiologie en voor klassieke statistische toepassingenaties.
Ten eerste, aangezien alle fracties uit een enkel monster worden geëxtraheerd, wordt de variatie tussen de verschillende experimentele datasets (lipiden, metabolieten, eiwitten) aanzienlijk verminderd, aangezien elke dataset afgeleid is van hetzelfde monster-monster. Dit leidt duidelijk tot de verhoogde vergelijkbaarheid van de verkregen resultaten.
Ten tweede is de methode gemakkelijk schaalbaar en maakt het daarom zeer compatibel met kleine tot grote monsterhoeveelheden. We routinematig gebruik maken van 10-100 mg weefselmonsters, maar succesvolle lipidomische studies zijn ook uitgevoerd op zo weinig als 20 Arabidopsis zaden 31 . Vooral de verenigbaarheid met kleine monsterhoeveelheden maakt deze methode van toepassing als er beperkte hoeveelheden biologische weefsels of monsters beschikbaar zijn. Toch is er, zelfs als er voldoende materiaal beschikbaar is, de methode die hier wordt gepresenteerd, het voordeel om deze monsters in een groter aantal experimentele replicaten te gebruiken in plaats van uZing ze voor verschillende extractieprocedures. Dit zorgt voor een betere en verfijnde statistische data analyse.
Ten derde, aangezien de werkwijze is gebaseerd op een vloeistof-vloeibare fractionering van polaire en niet-polaire moleculen, verschaft het in tegenstelling tot eenvoudige eenfase-extractiemethoden ( bijv. Methanol-extracties) een significante ontcomplexeringsstap in de procedure. Dit efficiënte monster-ontplooiing leidt tot een gedeeltelijke zuivering van de individuele fracties als gevolg van de scheiding van chemisch interfererende moleculen van elkaar. Bijgevolg levert het chemische scheidingsproces niet alleen een praktisch voordeel voor het systematisch aliquoteren van de geëxtraheerde monsters in verschillende chemische klassen, maar verbetert ook de individuele analytische metingen, aangezien het verontreinigende verbindingen uit de verschillende fracties verwijdert. Het is duidelijk, dat we vooral kunnen observeren dat de lipiden, die zijn verdeeld in de organische fase en die meestal een negatieve invloed hebben op de lipidenChromatografische analyse van polaire verbindingen, zal bijna volledig afwezig zijn van de polaire fractie. Hetzelfde geldt voor de analyse van de hydrofobe lipiden, die uit de polaire verbindingen worden uitgeput. Naast de zuivering van polaire en niet-polaire verbindingen uit elkaar nemen we eiwitten en andere macro-moleculen uit het monster af en verzamelen ze niet alleen een aparte fractie, die kan worden gebruikt voor eiwit-, zetmeel- en celwandanalyse 16 , maar ook Leidt tot een schonere monster binnen de individuele fracties. Dit is vooral relevant, omdat het bekend is dat de aanwezigheid van grote macromoleculen leidt tot schade of ten minste kortere levensduur van de analytische kolommen.
Ten slotte is de beschreven MTBE-extractiemethode, die gebaseerd is op het minder gevaarlijke en gunstiger chloroform-vervangingsoplosmiddel 15 , al door verschillende onderzoeken uit onze groep getoondIcability voor verschillende biologische monsters van planten 16 , algen 17 , 18 , vliegen 19 maar ook verscheidene zoogdierweefsels, organen of cellen 20 , 21 , 22 .
The authors have nothing to disclose.
MS wordt ondersteund door een volledige PhD-beurs uit het GERLS-DAAD programma. Wij bedanken dr. Andrew Wiszniewski voor het bewijs lezen en commentaar geven op het manuscript. Wij zijn zeer dankbaar voor alle leden van het Giavalisco lab in Max-Planck Instituut voor Moleculaire Plantfysiologie, Golm, Duitsland voor hun hulp.
Reagents and standards | |||
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Equipment | |||
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Tissue grinding mixer mill | Retsch, Mixer Mill MM 300 | 20.746.0001 | |
Mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464-1EA | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
MS system | Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany). | ||
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system | Thermo-Fisher, Bremen, Germany | Analysis of peptides |