Analisi completa della metilazione del DNA usando un metodo basato sulla cattura di dominio di metile-CpG in pazienti con leucemia linfocitica cronica

L'utilizzo di tecniche di sequenziamento di nuova generazione per l'analisi dei profili di metilazione del DNA globale è diventato sempre più popolare negli ultimi anni. I metodi di metilazione a livello genomico, compresi metodi basati su microarray e non microarray, sono stati sviluppati in base a quanto segue: la conversione di bisulfite di DNA genomico, digestioni enzimatiche di restrizione sensibile alla metilazione e l'immunoprecipitazione del DNA metilato usando anticorpi specifici di metil CpG .

La metilazione aberrante del DNA è uno dei segni distintivi della leucemia e dei linfomi, inclusa la leucemia linfocitica chirurgica (CLL). In precedenza, diversi gruppi compresi i nostri caratterizzavano i profili di metilazione del DNA di diversi sottogruppi CLL e dei normali e sani controlli delle cellule B usando la conversione bisulfa del DNA genomico seguita da metodi basati su micro-array o sequenziamenti interi genomi ^{1 , 2 , 3 ,} <Sup class = "xref"> 4. La conversione di bisulfite del DNA genomico conduce alla deaminazione di citosine non modificate all'uracil, lasciando le citosine metilate modificate nel genoma. Una volta convertito, lo stato di metilazione del DNA può essere determinato mediante amplificazione e sequenza PCR utilizzando diversi metodi quantitativi o qualitativi, come il sequenziamento di bisulfite a base di micro-array o intero genoma (WGBS). Sebbene i metodi basati sulla conversione di bisolfito abbiano molti vantaggi e sono ampiamente usati in diversi tipi di cancro per analizzare i livelli di metilazione del DNA, ci sono alcuni inconvenienti associati a questa tecnica. Il sequenziamento di WGBS consente la risoluzione di una coppia di basi con quantità minori di DNA ed è l'opzione migliore per analizzare un gran numero di campioni. Tuttavia, questo metodo non riesce a differenziare le modifiche tra i livelli di 5 mC e 5 hmC nel genoma ^{5 , 6} . Inoltre, i metodi basati su microarray non offrono completa cSopravvivenza del genoma.

In un recente studio del nostro laboratorio ⁷ , sono stati utilizzati metodi basati su immunoprecipitazione, piuttosto che la conversione di bisulfite, per identificare regioni ricche di CpG ricche e differenziate su scala globale nei pazienti CLL e nei controlli normali sani. Il sequenziamento di prossima generazione (MBD-seq) del dominio di binding inmetil-CpG (MBD), l'arricchimento del DNA frammentato a doppio filamento dipende dal grado di metilazione di CpG. Questo metodo può superare gli inconvenienti del metodo di conversione di bisulfite e può anche fornire una copertura genomica della metilazione CpG in modo indipendente e indipendente dalla PCR. Inoltre, a differenza dei metodi di microarray basati su conversione a base di bisolfito, MBD-seq può essere utilizzato per analizzare lo stato di metilazione degli elementi ripetitivi, quali elementi nucleari interrati lunghi (LINEs), elementi nucleari interspersati corti (SINEs), ripetizioni terminali lunghe (LTRS) Ecc . Tuttavia, rispetto ai metodi di conversione di bisolfito,Un protocollo MBD-seq richiede una quantità relativamente elevata di DNA di input. Inoltre, la qualità dei sequenziamenti legge e i dati dipendono dalla specificità, affinità e qualità degli anticorpi utilizzati.

Lo studio corrente spiega un dettagliato protocollo MBD-seq per arricchire il DNA metilato per la sequenza di nuova generazione. Utilizza un kit di arricchimento di legame metilato commerciale (elencato nella tabella dei materiali ), nonché una pipeline computazionale per visualizzare e interpretare i dati di sequenziamento della metilazione per identificare le regioni iper- e ipometilate specifiche CLL rispetto ai controlli normali sani. Fondamentalmente, questo metodo utilizza la capacità dell'MBD dell'interazione con proteine ​​umane MBD2 con CpG metilati per estrarre il DNA arricchito con CpG metilati, e questo è seguito dal sequenziamento ad alta percentuale di DNA metilato.