在慢性淋巴细胞性白血病患者中使用甲基CpG结合域捕获法进行综合DNA甲基化分析

近年来，使用下一代测序技术分析全球DNA甲基化谱已越来越受欢迎。基于全基因组的甲基化测定，包括基于微阵列和非微阵列的方法，基于以下方法开发：基因组DNA的亚硫酸氢盐转化，甲基化敏感的限制酶消化和甲基化DNA的免疫沉淀，使用甲基CpG特异性抗体。

异常DNA甲基化是白血病和淋巴瘤的标志之一，包括慢性淋巴细胞性白血病（CLL）。早些时候，包括我们在内的几个组织表征不同CLL预后亚组和正常健康B细胞对照的DNA甲基化谱，使用基因组DNA的亚硫酸氢盐转化，然后是基于微阵列的方法或全基因组测序^{1,2,3 ，} <sup class =“xref”> 4。基因组DNA的亚硫酸氢盐转化导致未修饰的胞嘧啶脱氨酸尿嘧啶，留下基因组中修饰的甲基化胞嘧啶。一旦转化，DNA的甲基化状态可以通过PCR扩增和使用不同的定量或定性方法如基于微阵列或全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）的测序来测定。尽管基于亚硫酸氢盐转化的方法具有许多优点，并且广泛用于不同的癌症类型以分析DNA甲基化水平，但与该技术相关的一些缺点是。 WGBS测序允许单碱基对分辨率较低的DNA，是分析大量样品的最佳选择。然而，这种方法不能区分基因组中5mC和5mmC水平之间的修饰。此外，基于微阵列的方法不提供完整的c基因组超量。

在我们实验室⁷最近的一项研究中，基于免疫沉淀的方法，而不是亚硫酸氢盐转化，用于在CLL患者和正常健康对照组中在全球范围内鉴定高度富含CpG的差异甲基化区域。在甲基CpG结合域（MBD）下一代测序（MBD-seq）中，双链片段化DNA的富集取决于CpG甲基化程度。该方法可以克服亚硫酸氢盐转化方法的缺点，并且还可以以无偏差和不依赖PCR的方式提供CpG甲基化的全基因组覆盖。此外，与基于亚硫酸氢盐转化的微阵列方法不同，MBD-seq可用于分析重复元件的甲基化状态，例如长散布核元素（LINE），短散点核元素（SINE），长末端重复序列（LTRS） 等等然而，与亚硫酸氢盐转化方法相比，MBD-seq协议需要相当大量的输入DNA。此外，测序的质量读数和数据取决于所用抗体的特异性，亲和性和质量。

目前的研究解释了详细的MBD-seq方案来丰富用于下一代测序的甲基化DNA。它使用商业甲基化DNA结合浓缩试剂盒（在材料表中列出 ），以及计算流程，用于显示和解释甲基化测序数据，以鉴定与正常健康对照相比的CLL特异性高和低甲基化区域。基本上，这种方法利用人类MBD2蛋白与甲基化CpG相互作用的MBD的能力来提取富含甲基化CpG的DNA，其次是甲基化DNA的高通量测序。