Комплексный анализ метилирования ДНК с использованием метода Methyl-CpG-связывающего домена для захвата у пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией

Использование технологий последующего секвенирования для анализа глобальных профилей метилирования ДНК в последние годы пользуется все большей популярностью. Анализы метилирования в масштабе всего генома, включая методы на основе микрочипов и не микрочипов, были разработаны на основе следующего: бисульфитная конверсия геномной ДНК, чувствительность к метилированию рестрикционных ферментов и иммунопреципитация метилированной ДНК с использованием метил-CpG-специфических антител ,

Метилирование ДНК аберранта является одним из признаков лейкемии и лимфом, включая хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ). Ранее несколько групп, в том числе наши, характеризовали профили метилирования ДНК различных прогностических подгрупп CLL и нормальные здоровые B-клеточные контрольные группы с использованием бисульфитной конверсии геномной ДНК с последующими методами на основе микро-матрицы или секвенированием цельного генома ^{1 , 2 , 3 ,} <Sup class = "xref"> 4. Бисульфитная конверсия геномной ДНК приводит к дезаминированию немодифицированных цитозинов к урацилу, оставляя модифицированные метилированные цитозины в геноме. После преобразования статус метилирования ДНК может быть определен с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования с использованием различных количественных или качественных методов, таких как бисульфитное секвенирование на основе микроячейки или цельного генома (WGBS). Хотя методы, основанные на использовании бисульфита, имеют много преимуществ и широко используются в разных типах рака для анализа уровней метилирования ДНК, есть несколько недостатков, связанных с этим методом. Секвенирование WGBS позволяет разрешать однобазовую пару с меньшим количеством ДНК и является наилучшим подходящим вариантом для анализа большого количества образцов. Однако этот метод не позволяет дифференцировать модификации между уровнями 5 мК и 5 hmC в геноме ^{5 , 6} . Кроме того, методы на основе микрочипов не предлагают полного cИзбыток генома.

В недавнем исследовании из нашей лаборатории ⁷ методы, основанные на иммунопреципитации, а не конверсия бисульфита, были использованы для идентификации высококонцентрированных, дифференцированных метилированных областей CpG в глобальном масштабе у пациентов с ХЛЛ и нормального здорового контроля. Секвенирование следующего поколения inmethyl-CpG-связывающего домена (MBD) (MBD-seq), обогащение двухцепочечной фрагментированной ДНК зависит от степени метилирования CpG. Этот способ может преодолеть недостатки метода конверсии бисульфита и может также обеспечить общий охват генотипированием CpG в геноме несмещенным и ПЦР-независимым образом. Кроме того, в отличие от методов микрочипов на основе конверсии на основе бисульфита, MBD-seq может использоваться для анализа статуса метилирования повторяющихся элементов, таких как длинные вкрапленные ядерные элементы (LINE), короткие вкрапленные ядерные элементы (SINE), длинные концевые повторы (LTRS) И т.д. Однако по сравнению с методами конверсии бисульфита,Для протокола MBD-seq требуется относительно большое количество входной ДНК. Кроме того, качество чтения последовательности и данные зависят от специфичности, сродства и качества используемых антител.

В настоящем исследовании объясняется подробный протокол MBD-seq для обогащения метилированной ДНК для секвенирования следующего поколения. Он использует коммерческий набор метилированного ДНК-связывающего обогащения ( указанный в Таблице материалов ), а также вычислительный трубопровод для визуализации и интерпретации данных секвенирования метилирования для определения специфичных к ХЛЛ гипер- и гипометилированных областей по сравнению с нормальным здоровым контролем. В принципе, этот метод использует способность MBD взаимодействия человеческого белка MBD2 с метилированными CpG для экстракции ДНК, обогащенной метилированными CpG, и за этим следует высокопроизводительное секвенирование метилированной ДНК.