Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten

Die Verwendung von Sequenztechniken der nächsten Generation zur Analyse globaler DNA-Methylierungsprofile wurde in den letzten Jahren zunehmend populär. Genom-weite Methylierungs-Assays, einschließlich Mikroarray- und Nicht-Mikroarray-basierte Methoden, wurden auf der Grundlage der folgenden entwickelt: die Bisulfit-Umwandlung von genomischer DNA, methylierungsempfindliche Restriktionsenzymverdauungen und die Immunpräzipitation von methylierter DNA unter Verwendung von Methyl-CpG-spezifischen Antikörpern .

Aberrant DNA-Methylierung ist eines der Kennzeichen der Leukämie und Lymphome, einschließlich der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL). Früher charakterisierten mehrere Gruppen, einschließlich unserer, die DNA-Methylierungsprofile verschiedener CLL-prognostischer Untergruppen und normale, gesunde B-Zell-Kontrollen unter Verwendung der Bisulfit-Umwandlung von genomischer DNA, gefolgt von Mikro-Array-basierten Methoden oder Voll-Genom-Sequenzierung ^{1 , 2 , 3 ,} <Sup class = "xref"> 4. Die Bisulfit-Umwandlung von genomischer DNA führt zur Deamination von unmodifizierten Cytosinen zu Uracil, wobei die modifizierten methylierten Cytosine im Genom zurückbleiben. Nach der Umwandlung kann der Methylierungsstatus der DNA durch PCR-Amplifikation und Sequenzierung unter Verwendung unterschiedlicher quantitativer oder qualitativer Methoden, wie z. B. Mikro-Array-basierte oder Voll-Genom-Bisulfit-Sequenzierung (WGBS), bestimmt werden. Obwohl Bisulfit-umwandlungsbasierte Verfahren viele Vorteile haben und in verschiedenen Krebsarten weit verbreitet sind, um DNA-Methylierungsniveaus zu analysieren, gibt es einige Nachteile, die mit dieser Technik verbunden sind. Die WGBS-Sequenzierung ermöglicht eine Single-Base-Paar-Auflösung mit niedrigeren DNA-Mengen und ist die beste geeignete Option zur Analyse einer großen Anzahl von Proben. Diese Methode unterscheidet jedoch nicht die Modifikationen zwischen den 5 mC und 5 hmC Ebenen im Genom ^{5 , 6} . Darüber hinaus bieten Microarray-basierte Methoden nicht komplette cÜberleben des Genoms

In einer aktuellen Studie aus unserem Labor ⁷ wurden immunpräzipitationsbasierte Verfahren anstelle von Bisulfit-Umwandlung verwendet, um hochgradig CpG-reiche, differentiell methylierte Regionen auf globaler Ebene bei CLL-Patienten und normalen gesunden Kontrollen zu identifizieren. Inmethyl-CpG-bindende Domäne (MBD) Sequenzierung der nächsten Generation (MBD-seq), die Anreicherung von doppelsträngiger fragmentierter DNA hängt vom Grad der CpG-Methylierung ab. Dieses Verfahren kann die Nachteile des Bisulfit-Umwandlungsverfahrens überwinden und kann auch eine genomweite Abdeckung der CpG-Methylierung in einer unvoreingenommenen und PCR-unabhängigen Weise bereitstellen. Zusätzlich kann im Gegensatz zu auf der Basis von Bisulfit-umwandlungsbasierten Mikroarray-Methoden MBD-seq verwendet werden, um den Methylierungsstatus von sich wiederholenden Elementen zu analysieren, wie z. B. lange durchbrochene nukleare Elemente (LINEs), kurze durchbrochene nukleare Elemente (SINEs), lange terminale Wiederholungen (LTRS) Usw. Im Vergleich zu Bisulfit-Umwandlungsverfahren,Ein MBD-seq-Protokoll erfordert eine relativ große Menge an Input-DNA. Auch die Qualität der Sequenzierung liest und die Daten hängen von der Spezifität, Affinität und Qualität der verwendeten Antikörper ab.

Die aktuelle Studie erklärt ein detailliertes MBD-seq-Protokoll, um methylierte DNA für die Sequenzierung der nächsten Generation zu bereichern. Es verwendet ein kommerzielles, methyliertes DNA-Bindungsanreicherungs-Kit (aufgeführt in der Materialtabelle ) sowie eine rechnerische Pipeline zur Visualisierung und Interpretation von Methylierungssequenzdaten zur Identifizierung von CLL-spezifischen hyper- und hypomethylierten Regionen im Vergleich zu normalen gesunden Kontrollen. Grundsätzlich nutzt dieses Verfahren die Fähigkeit des MBD der humanen MBD2-Protein-Wechselwirkung mit methylierten CpGs, um mit Methyl-CpGs angereicherte DNA zu extrahieren, worauf die Hochdurchsatz-Sequenzierung von methylierter DNA folgt.