Summary

在慢性淋巴细胞性白血病患者中使用甲基CpG结合域捕获法进行综合DNA甲基化分析

Published: June 16, 2017
doi:

Summary

该工作描述了优化的甲基CpG结合结构域(MBD)测序方案和用于鉴定慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者中差异甲基化CpG富集区的计算管道。

Abstract

长期非编码RNA(lncRNA)在癌症中的作用已经走在前列,因为在癌症发展和进展期间越来越需要了解其机械功能。尽管如此,在癌症中lncRNA和重复序列的全球表观遗传调控尚未得到很好的研究,特别是在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中。本研究着重于一种独特的方法:使用甲基结合结构域(MBD)蛋白进行基于免疫沉淀的双链甲基化DNA片段捕获,随后进行下一代测序(MBD-seq)。本研究使用属于两个预后亚组(5个IGVH突变样本+ 5个IGVH未突变样本)的CLL患者样本。与正常健康对照相比,分析显示5,800个高甲基化和12,570个低甲基化的CLL特异性差异甲基化基因(cllDMG)。重要的是,这些结果确定了几种CLL特异性差异甲基化的lncRNA具有潜在预后价值的蛋白质编码基因。该工作概述了MBD-seq和生物信息学管道的详细协议,用于使用CLL患者样本全面分析高CpG丰富地区的全球甲基化谱。最后,使用焦磷酸测序验证蛋白质编码基因和lncRNA,这是一种高度定量的方法来分析CpG甲基化水平,以进一步证实MBD-seq方案的发现。

Introduction

近年来,使用下一代测序技术分析全球DNA甲基化谱已越来越受欢迎。基于全基因组的甲基化测定,包括基于微阵列和非微阵列的方法,基于以下方法开发:基因组DNA的亚硫酸氢盐转化,甲基化敏感的限制酶消化和甲基化DNA的免疫沉淀,使用甲基CpG特异性抗体。

异常DNA甲基化是白血病和淋巴瘤的标志之一,包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。早些时候,包括我们在内的几个组织表征不同CLL预后亚组和正常健康B细胞对照的DNA甲基化谱,使用基因组DNA的亚硫酸氢盐转化,然后是基于微阵列的方法或全基因组测序1,2,3 <sup class =“xref”> 4。基因组DNA的亚硫酸氢盐转化导致未修饰的胞嘧啶脱氨酸尿嘧啶,留下基因组中修饰的甲基化胞嘧啶。一旦转化,DNA的甲基化状态可以通过PCR扩增和使用不同的定量或定性方法如基于微阵列或全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)的测序来测定。尽管基于亚硫酸氢盐转化的方法具有许多优点,并且广泛用于不同的癌症类型以分析DNA甲基化水平,但与该技术相关的一些缺点是。 WGBS测序允许单碱基对分辨率较低的DNA,是分析大量样品的最佳选择。然而,这种方法不能区分基因组中5mC和5mmC水平之间的修饰。此外,基于微阵列的方法不提供完整的c基因组超量。

在我们实验室7最近的一项研究中,基于免疫沉淀的方法,而不是亚硫酸氢盐转化,用于在CLL患者和正常健康对照组中在全球范围内鉴定高度富含CpG的差异甲基化区域。在甲基CpG结合域(MBD)下一代测序(MBD-seq)中,双链片段化DNA的富集取决于CpG甲基化程度。该方法可以克服亚硫酸氢盐转化方法的缺点,并且还可以以无偏差和不依赖PCR的方式提供CpG甲基化的全基因组覆盖。此外,与基于亚硫酸氢盐转化的微阵列方法不同,MBD-seq可用于分析重复元件的甲基化状态,例如长散布核元素(LINE),短散点核元素(SINE),长末端重复序列(LTRS) 等等然而,与亚硫酸氢盐转化方法相比,MBD-seq协议需要相当大量的输入DNA。此外,测序的质量读数和数据取决于所用抗体的特异性,亲和性和质量。

目前的研究解释了详细的MBD-seq方案来丰富用于下一代测序的甲基化DNA。它使用商业甲基化DNA结合浓缩试剂盒(在材料表中列出 ),以及计算流程,用于显示和解释甲基化测序数据,以鉴定与正常健康对照相比的CLL特异性高和低甲基化区域。基本上,这种方法利用人类MBD2蛋白与甲基化CpG相互作用的MBD的能力来提取富含甲基化CpG的DNA,其次是甲基化DNA的高通量测序。

Protocol

收集CLL样本的道德准许是2007-05-21,具有以下注册号:EPN Gbg dnr 239/07。所有CLL患者根据最近修订的标准8诊断,并在诊断时收集样品。在获得书面同意后,研究中的患者被纳入瑞典西部不同血液学部门。本研究仅选择了白血病细胞百分率≥70%的CLL外周血单个核细胞(PBMC)样本。 准备工作根据制造商的说明书,使用商业分离试剂盒(参见材料表</s…

Representative Results

最近对CLL患者和匹配的正常健康对照进行了MBD-seq,以鉴定CLL特异性差异超低和低甲基化基因7 。用于分析CLL和正常健康样品产生的数据的实验和生物信息管道如图1A和1B所示 。这些分析确定了几个CLL特异性差异甲基化区域(cllDMR),与对照样品相比,IGHV突变和IGHV未突变样品显着高/低甲基化,p值<0.00001。 <strong class="xf…

Discussion

MBD-seq是一种经济有效的基于免疫沉淀的技术,可用于研究具有完整全基因组范围覆盖的甲基化模式。 MeDIP seq(甲基化DNA免疫沉淀随后测序)和MBD-seq均导致富含CpG的甲基化DNA的富集。然而,与MeDIP seq 19相比,MBD-seq对结合高度富含CpG的区域具有更强的亲和力。使用甲基结合富集试剂盒,可以分别通过高盐和低盐缓冲液洗脱DNA将DNA分馏成高CpG和低CpG富集区。在该研究中,仅进行单?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

瑞典研究委员会,瑞典癌症协会,Knut和爱丽丝·瓦伦贝格基金会(KAW)以及FoUVästraGötalandsregionen都支持这项研究。

Materials

Dneasy Blood and tissue kit Qaigen 69504
Lymphoprep solution A X I S-S H I E L D 1114544
Nano drop 2000 Thermo Fischersceintific
TE buffer PH 8 Sigma aldrich 93283
Bioruptor standard sonication device Diagenode UCD-200
TPX bioruptor tubes 1.5ml Diagenode C30010010-300
3 M Sodium acetate Diagenode C03030002
E-gel iBase safe imager combo kit Thermo Fischersceintific G6465EU
E-gel 2% Agarose gels Thermo Fischersceintific G441002
Methylminer Methylated DNA enrichment kit Thermo Fischersceintific ME10025
Labquake Tube Shaker/Rotators Thermo Fischersceintific 415110
Dynal MPC-S Thermo Fischersceintific A13346
Vortex mixer VWR 12620-848
Absolute Ethanol Any company
70% Ethanool Any company
DNAse free water Milli Q
DNA precipitant (3M sodium acetate) Diagenode C03030002
Safe seal 1.5ml eppendorf tubes Eppendorf 4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fischersceintific Q32851
Qubit 0.5ml tubes Thermo Fischersceintific Q32856
Qubit Thermo Fischersceintific Q32866
Illumina Hiseq2000 Platform Illumina
Water  Bath Grant
Heat block grant
Tube rotater Labquake

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Diesen Artikel zitieren
Subhash, S., Kanduri, M. Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients. J. Vis. Exp. (124), e55773, doi:10.3791/55773 (2017).

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