난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성
Summary
마우스 oocytes의 microinjection는 일반적인 transgenesis ( 즉, transgenes의 무작위 통합) 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅 모두에 일반적으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략에 중점을두고 마이크로 인젝션의 최신 개발 상황을 검토합니다.
Abstract
유전자 조작 마우스의 사용은 생체 내 및 병리학 적 생체 내 과정 모두에 대한 연구에 크게 기여했다. 수정 된 난 모세포 내로의 DNA 발현 구조물의 전 핵 주입은 과발현을위한 형질 전환 쥐를 생성하는 가장 보편적 인 기술로 남아있다. 유전자 표적화를위한 CRISPR 기술이 도입됨에 따라 수정 된 난 모세포에 전핵을 주입하여 knockout과 knockin 마우스를 생성 할 수있게되었다. 이 연구는 유전자 타겟팅을위한 사출 용 DNA의 준비와 CRISPR 가이드의 생성을 기술하고 있으며 특히 품질 관리에 중점을두고 있습니다. 잠재적 인 창시자를 확인하는 데 필요한 유전형 분석 절차가 중요합니다. CRISPR의 "멀티플렉싱"기능을 활용하는 혁신적인 유전자형 전략이 여기에 제시됩니다. 수술 절차도 요약되어 있습니다. 함께, 프로토콜의 단계는 세대의 생성을 허용합니다면역학, 신경 과학, 암, 생리학, 발달 및 기타를 포함한 수많은 연구 분야에서 마우스 식민지를 확립하는 데 사용됩니다.
Introduction
척추 동물과 무척추 동물의 동물 모델은 알츠하이머 병과 같은 인간의 병태 생리학을 검사하는 도구가되어왔다. 그들은 질병 치료제를 찾고 궁극적으로 완치를위한 새로운 치료 전략을 개발할 수있는 귀중한 도구이기도합니다. 각 모델에는 본질적인 한계가 있지만, 전신 모델로 동물을 사용하는 것은 생물 의학 연구에 필수적입니다. 이것은 신진 대사와 복잡한 생리 환경이 조직 배양에서 완전히 모의 될 수 없기 때문입니다.
지금까지 마우스는 유전자 조작에 사용되는 가장 일반적인 포유류 종으로 남아 있기 때문에 몇 가지 장점이 있습니다. 질병과 관련된 생리적 과정과 유전자는 생쥐와 인간 사이에서 매우 잘 보존되어 있습니다. 마우스는 인간 게놈보다 일년 전에 (2002 년) 전체 유전체 염기 서열을 갖는 최초의 포유 동물이었다.나 (2003). 이 풍부한 유전자 정보 외에, 번식 능력이 좋고 발달주기가 빠르며 (수정으로부터 이유식까지 6 주) 적당한 크기입니다. 뚜렷한 외투 색상 (교차 전략에 필요)과 같은 생리적 인 지표와 결합 된 이러한 모든 장점은 마우스를 유전자 조작을위한 매력적인 모델로 만들었습니다. 주목할 만하게, 현대 유전학의 아주 이른 나이에서는, Gregor Mendel는 식물 3으로 움직이기 전에 쥐에 종사 시작했다.
유전자 전달 기술은 바이러스 성 전달을 이용하여 처음 생성 된 30 년 전의 첫 번째 형질 전환 마우스의 생성을 가져왔다. 그러나 연구자들은 곧 마우스 전이의 주요 과제 중 하나가 외인성 DNA의 운명을 제어 할 수 없다는 것을 깨달았습니다. 마우스 난 모세포로 형질 전환 유전자를 바이러스로 전달하면 게놈에 무작위로 여러 복제물이 통합되기 때문에,후속 형질 전환 계통을 확립하는 것이 제한적이었다.
이러한 한계 중 하나는 Gordon et al. microinjection 5 , 6 에 의한 최초의 형질 전환 마우스 라인을 생성했다. 이것은 재조합 DNA 기술의 시대를 열었고 마이크로 인젝션 세션의 결과에 영향을 미치는 매개 변수가 널리 연구되었습니다 7 . 마이크로 인젝션 (microinjection)은 형질 도입 유전자의 통합 부위에 대한 제어를 허용하지 않지만 (결과적으로 각 창 마우스에 대한 특이적인 발현 수준을 유도 함), 전 핵 마이크로 인젝션의 주요 이점은 컨 테이너 (concatemer)의 형성이다 ( 즉 , 게놈 통합 이전에 시리즈로 링크 됨) 5 . 이러한 특성은 수년 동안 관심있는 유전자를 과발현하는 수천 개의 트랜스 제닉 마우스 라인을 수립하는데 사용되었습니다. 그 이후로 유전자 변형,유기체 게놈의 인공 수정은 질병 발생시 단일 유전자의 역할을 확인하는 데 광범위하게 사용되었습니다.
마리오 카 페치 (Mario Capecchi)가 생쥐의 단일 유전자를 성공적으로 파괴하여 유전자 표적화 시대를 열었을 때 마우스 게놈을 조작하는 데있어 중요한 성과를 달성했습니다. 그러나 ES 세포 배양의 어려움, 약간의 가변성의 키메라 (chimerism) 정도, 과정의 길이 ( 즉, 마우스를 얻는 데 최소 12-18 개월)를 비롯하여 ES 세포 기반 유전자 표적화에서 주요 단점이 빠르게 나타났다. .
최근에, ZFN, TALEN 및 CISPR / Cas9와 같은 신기술의 진보가 대체 방법으로 등장했다. 마이크에서 유전자 타겟팅 과정을 가속화한다.e 9 , 10 . 이 endonucleases는 microinjection에 의해 마우스 난 모세포에 쉽게 주입 될 수 있으며, 6 주 이내에 유전자 표적 마우스를 생성 할 수 있습니다.
게놈 편집을위한 CRISPR 사용에 관한 첫 번째 보고서 이후이 박테리아 적응 면역 시스템은 ZFN과 TALEN을 대체했으며 그 이유는 합성의 용이함과 동시에 여러 유전자좌를 표적으로하는 능력 ( "멀티플렉싱 "). CRISPR은 생쥐 12 번에서 유전자 타겟팅에 처음 사용되었으며 이후 식물에서 사람 13,14 로 무수한 종에 적용되었습니다. 현재까지 CRISPR 게놈 편집에 저항하는 단일 종에 대한보고는 없다.
유전자 변형 생쥐의 생성의 두 가지 주요 제한 단계는 난 모세포의 주입과 재 이식이 난 모세포를 가짜 임신 한 암컷으로 이 기술은 우리와 15 에 의해 기술되었지만 최근의 쥐 발생학 및 유전자 전달 기술의 기술적 향상은 유 전적으로 변형 된 쥐를 생성하는 과정에 혁명을 일으켰습니다. 이러한 개선 사항은 여기에 설명됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 내 중요 단계
유전자 변형 마우스의 생성은 기술적으로 어려운 것으로 알려져 있습니다. 그러나 여기에 제시된 프로토콜은 기록적인 시간에 기술을 마스터하고 문제를 해결할 수 있도록 최적화되고 단순화 된 방법입니다. 이 기술을 성공적으로 완료하려면 두 단계가 필요합니다. 첫째, 염화 마그네슘 (MgCl 2 )없이 선형 DNA 템플릿 (sgRNA 합성 용)의 합성이 가능?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 지속적인 지원을 위해 동물 시설 (BRC) 직원에게 감사를드립니다. 이 작품은 국가 건강 및 의학 연구 협의회 (National Health and Medical Research Council)와 호주 연구위원회 (Australian Research Council)의 지원을 받았다.
Materials
| Micropipette 0.1-2.5 ul | Eppendorf | 4920000016 | |
| Micropipette 2-20 ul | Eppendorf | 4920000040 | |
| Micropipette 20-200 ul | Eppendorf | 4920000067 | |
| Micropipette 100-1000 ul | Eppendorf | 4920000083 | |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1kb |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x – Dilute to 1x |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| PCR purification kit (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| Vacuum system (Manifold) | Promega | A7231 | |
| Nuclease-free microinjection buffer | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC microcentrifuge filter | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR expressing plasmid (px330) | Addgene | 42230 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA purification spin columns (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| Donor plasmid | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa embryo culture medium | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| Mineral oil | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Mouthpiece | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Glass microcapillaries | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Proteinase K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Vessel clamp | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| Wound clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Clips applier | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 incubator | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| Electrophoresis set up | BioRad | 1640300 | |
| UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| 2x Micromanipulators | Eppendorf | 5188000.012 | |
| Oocytes manipulator | Eppendorf | 5176000.025 | |
| Microinjector (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| Mice C57BL/6J strain | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
Referenzen
- Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer’s disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
- Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer’s mice. Science. 354 (6314), 904-908 (2016).
- Marantz Henig, R. . The Monk in the Garden. , (2000).
- Jaenisch, R., Mintz, B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).
- Carbery, I. D. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetik. 186 (2), 451-459 (2010).
- Sung, Y. H. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).
- Jinek, M. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wang, H. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kang, X. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).
- Liang, P. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).
- Ittner, L. M., Götz, J. Pronuclear injection for the production of transgenic mice. Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- . Resuspension Calculator Available from: https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/ (2017)
- Auerbach, A. B. Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production. Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).
- Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months. Biol Reprod. 86 (2), 49 (2012).
- Nakagawa, Y., et al. Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice. Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).
- Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 29 (17), E88 (2001).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nat Commun. 7, 10431 (2016).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. , (2016).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Liu, X., et al. A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling. J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).
- Ke, Y. D. Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS. Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).
- Auerbach, A. B. Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection. Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Zhou, Y. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum. Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).
- Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection. Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).
- Biggers, J. D., Summers, M. C. Choosing a culture medium: making informed choices. Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).
- Nakagata, N. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).
- Truett, G. E. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
- Delerue, F., Ittner, L. M. Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects. Clon. Transgen. 4, (2015).
