Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

I modelli animali, sia in vertebrati che in invertebrati, sono stati strumentali ad esaminare la fisiopatologia delle condizioni umane come la malattia di Alzheimer ^{1 , 2} . Sono anche strumenti preziosi per la ricerca di modificatori della malattia e per sviluppare in ultima analisi nuove strategie di trattamento nella speranza di una cura. Sebbene ogni modello abbia limiti intrinseci, l'uso degli animali come interi modelli sistemici è fondamentale per la ricerca biomedica. Questo perché l'ambiente fisiologico metabolico e complesso non può essere interamente simulato nella cultura del tessuto.

Fino ad oggi, il topo rimane la specie mammiferi più diffusa per la manipolazione genetica perché presenta diversi vantaggi. I processi fisiologici e i geni associati alle malattie sono altamente conservati tra topi e esseri umani. Il topo è stato il primo mammifero a sequenziare il proprio genoma (2002), un anno prima del genoma umanoMe (2003). Oltre a questa ricchezza di informazioni genetiche, il mouse ha buone capacità di allevamento, un veloce ciclo di sviluppo (6 settimane dalla fecondazione allo svezzamento) e una dimensione ragionevole. Tutti questi vantaggi, accoppiati con indicatori fisiologici, come i colori del cappotto distinti (richiesti per le strategie di attraversamento), hanno reso il topo un modello attraente per la manipolazione genetica. Soprattutto, nella prima età della genetica moderna, Gregor Mendel ha iniziato a lavorare sui topi prima di passare alle piante ³ .

Le tecniche di trasferimento del gene hanno determinato la generazione del primo topo transgenico più di tre decenni fa ⁴ , inizialmente creato usando la consegna virale. Tuttavia, i ricercatori hanno subito capito che una delle principali sfide del transgenesi del mouse era l'incapacità di controllare il destino del DNA esogeno. Poiché la consegna virale di transgeni nei oociti del mouse ha portato a copie multiple integrate casualmente nel genoma, la possibilitY di stabilire linee transgeniche successive era limitata.

Una tale limitazione è stata superata quando Gordon et al. Ha generato la prima linea del mouse transgenica mediante microinjection ^{5 , 6} . Ciò ha inizio l'epoca della tecnologia del DNA ricombinante ei parametri che influenzano l'esito di una sessione di microinjection sono stati ampiamente studiati ⁷ . Sebbene la microinjection non consente di controllare il sito di integrazione del transgene (che alla fine determina livelli di espressione specifici per ogni mouse fondatore), il vantaggio principale della microinjection pronucleare rimane la formazione di concatenanti ( cioè, array di copie multiple del transgene, Collegati in serie) prima dell'integrazione genomica ⁵ . Questa caratteristica è stata utilizzata nel corso degli anni per stabilire migliaia di linee di topi transgenici che sovraespressionano un gene di interesse. Da allora, la transgenesis, l'aModificazione rtificale del genoma di un organismo, è stata ampiamente utilizzata per identificare il ruolo dei geni singoli nel verificarsi di malattie.

Un altro successo chiave nella manipolazione del genoma del mouse è stato raggiunto quando Mario Capecchi ha interrotto con successo un singolo gene nel topo, aprendo l'era del gene targeting ⁸ . Tuttavia, i principali inconvenienti sono emersi rapidamente dal targeting genico basato su cellule ES, incluse le sfide di coltura delle cellule ES, il grado di chimerismo un po 'variabile e la durata del processo ( ovvero 12-18 mesi, minimo per ottenere il topo) .

Recentemente, i metodi alternativi per le nuove tecnologie, come le endonucleasi ingegnerizzate ( es. Le nucleasi a dito di zinco (ZFN), le nucleasi efficace di attivazione della trascrizione (TALEN) e le cluster ripetute palindromiche brevi (CRISPR / Cas9) Accelerare il processo di targeting genico nel micE ^{9 , 10} . Queste endonucleasi possono essere facilmente iniettate in oociti del mouse mediante microinjection, permettendo la generazione di topi mirati per il gene in appena 6 settimane.

Dalla prima relazione sull'utilizzo di CRISPR per la modifica del genoma ¹¹ , questo sistema immunitario adattativo batterico ha sostituito ZFN e TALEN a causa dei suoi molti vantaggi, tra cui la facilità di sintesi e la capacità di individuare contemporaneamente più loci (indicati come "multiplexing "). CRISPR è stato utilizzato per l'individuazione genica nei topi ¹² e da allora è stato applicato a innumerevoli specie, dalle piante agli esseri umani ^{13 , 14} . Ad oggi non esiste alcuna relazione di una singola specie resistente al montaggio del genoma CRISPR.

Le due principali fasi di limitazione della generazione di topi transgenici sono l'iniezione di oociti e la reimplantazioneDi questi oociti in femmine pseudo-incinte. Anche se questa tecnica è stata descritta da noi ¹⁵ e altri ¹⁶ , i recenti miglioramenti tecnici nell'embrione del topo e nelle tecniche di trasferimento del gene hanno rivoluzionato il processo di generazione di topi geneticamente modificati. Questi miglioramenti saranno descritti qui.