Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d'ovocytes

Les modèles animaux, chez les vertébrés et les invertébrés, ont contribué à l'examen de la pathophysiologie des affections humaines telles que la maladie d'Alzheimer ^{1 , 2} . Ils sont également des outils précieux pour rechercher des modificateurs de maladies et pour finalement développer de nouvelles stratégies de traitement dans l'espoir d'un remède. Bien que chaque modèle ait des limites intrinsèques, l'utilisation des animaux comme modèles systémiques complets est essentielle à la recherche biomédicale. C'est parce que l'environnement physiologique métabolique et complexe ne peut pas être entièrement simulé dans la culture tissulaire.

À ce jour, la souris reste l'espèce de mammifère la plus commune utilisée pour la manipulation génétique car elle présente plusieurs avantages. Les processus physiologiques et les gènes associés aux maladies sont fortement conservés chez les souris et les humains. La souris a été le premier mammifère à avoir son génome complet séquencé (2002), un an avant le génome humainMoi (2003). Outre cette richesse de l'information génétique, la souris possède de bonnes capacités d'élevage, un cycle de développement rapide (6 semaines après la fertilisation jusqu'au sevrage) et une taille raisonnable. Tous ces avantages, couplés à des indicateurs physiologiques, tels que des couleurs de revêtement distinctes (requis pour les stratégies de croisement), ont fait de la souris un modèle attrayant pour la manipulation génétique. Notamment, au début de la génétique moderne, Gregor Mendel a commencé à travailler sur des souris avant de passer à des plantes ³ .

Les techniques de transfert de gènes ont entraîné la génération de la première souris transgénique il y a trois décennies ⁴ , initialement créée à l'aide de l'administration virale. Cependant, les chercheurs ont rapidement compris que l'un des principaux défis de la transgénèse de la souris était l'incapacité de contrôler le devenir de l'ADN exogène. Parce que l'administration virale de transgènes dans des ovocytes de souris a abouti à des copies multiples intégrées au hasard dans le génome, la possibilitéY d'établir des lignes transgéniques ultérieures était limité.

Une telle limitation a été surmontée lorsque Gordon et al. A généré la première ligne de souris transgénique par microinjection ^{5 , 6} . Cela a commencé l'ère de la technologie de l'ADN recombinant, et les paramètres influençant le résultat d'une session de micro-injection ont été largement étudiés ⁷ . Bien que la micro-injection ne permette pas le contrôle sur le site d'intégration du transgène (qui aboutit finalement à des niveaux d'expression spécifiques pour chaque souris fondatrice), l'avantage principal de la microinjection pronucléaire reste la formation de concatemers ( c.-à-d. Des tableaux de multiples copies du transgène, Liés en série) avant intégration génomique ⁵ . Cette caractéristique a été utilisée au cours des années pour établir des milliers de lignes de souris transgéniques qui surexpriment un gène d'intérêt. Depuis lors, la transgénèse, la aModification artificielle du génome d'un organisme, a été largement utilisée pour identifier le rôle des gènes simples dans l'apparition de maladies.

Une autre réalisation clé dans la manipulation du génome de la souris a été atteinte lorsque Mario Capecchi a perturbé avec succès un seul gène à la souris, ouvrant l'ère du ciblage des gènes ⁸ . Cependant, des inconvénients majeurs ont rapidement émergé du ciblage génétique basé sur les cellules ES, y compris les défis de la culture des cellules ES, le degré de chimérisme quelque peu variable et la durée du processus ( c'est-à-dire 12-18 mois minimum pour obtenir la souris) .

Récemment, les progrès dans les nouvelles technologies, telles que les endonucléases modifiées ( p. Ex., Les nucléases de doigts de zinc (ZFN), les nucléases effectrices de l'activateur de la transcription (TALEN) et les répétitions palindromiques courtes (CRISPR / Cas9) classées régulièrement sont apparues comme des méthodes alternatives Accélérer le processus de ciblage des gènes dans le microE ^{9 , 10} . Ces endonucléases peuvent être facilement injectées dans des ovocytes de souris par micro-injection, ce qui permet de générer des souris ciblées par gène en 6 semaines seulement.

Depuis le premier rapport sur l'utilisation de CRISPR pour l'édition génomique ¹¹ , ce système immunitaire adaptatif bactérien a remplacé ZFN et TALEN en raison de ses nombreux avantages, y compris la facilité de la synthèse et la capacité de cibler de multiples loci à la fois (appelés "multiplexage" "). Le CRISPR a d'abord été utilisé pour le ciblage des gènes chez la souris ¹² et a depuis été appliqué à d'innombrables espèces, des plantes aux humains ^{13 , 14} . À ce jour, aucun rapport d'une seule espèce n'est résistant à l'édition du génome CRISPR.

Les deux principales étapes limitantes de la génération de souris transgéniques sont l'injection d'ovocytes et la réimplantationDe ces ovocytes chez des femelles pseudo-grossières. Bien que cette technique ait été décrite par nous ¹⁵ et d'autres ¹⁶ , des améliorations techniques récentes dans l'embryologie de souris et les techniques de transfert de gènes ont révolutionné le processus de génération de souris génétiquement modifiées. Ces améliorations seront décrites ici.