재귀 신경 회로의 연구 : 빠른 신경 돌기 확장과 기능적 신경 연결을위한 새로운 방법
Summary
이 절차는 신경 돌기를 유도하는 마이크로 피펫에 고정 된 폴리 -D- 라이신 – 코팅 된 비드를 사용하여 마이크로 유체 챔버에서 조직화 된 신경을 신속하게 개시, 연장 및 연결하는 방법을 설명합니다.
Abstract
뇌와 척수 손상은 장거리에서 뉴런을 재생성하고 적절한 표적으로 정확하게 다시 연결할 수 없기 때문에 영구적 인 장애와 죽음을 초래할 수 있습니다. 여기서는 장거리에서 새로운 기능적 신경 회로를 신속하게 시작, 연장 및 정확하게 연결하는 절차가 설명됩니다. 달성 된 신장율은 말초 신경계에서 가장 빠르게 성장하는 축색 돌기의 생체 내 속도 (0.02-0.04mm / h)보다 30-60 배 빠르고 1.2mm / h를 초과하고 이전에보고 된 것보다 10 배 더 빠릅니다 발달의 초기 단계에서의 연결 유형 4 . 첫째, 쥐 hippocampal 뉴런의 고립 된 인구는 microfluidic 장치에서 2-3 주 동안 세포를 정확하게 위치시키기 위해 성장되어 쉽게 미세 조작과 실험적 재현성을 가능하게한다. 다음으로, poly-D-lysine (PDL)으로 코팅 된 비드를 신경 돌기에 위치시켜 접착 성 cont행동 및 피펫 micromanipulation 결과 비드 – 신경 자극 단지를 이동하는 데 사용됩니다. 비드가 움직일 때 수백 마이크로 미터 이상으로 확장되고 1 시간 이내에 목표 세포에 기능적으로 연결된 새로운 신경 돌기가 빠져 나옵니다. 이 과정은 실험 재현성과 조작의 용이성을 가능하게하면서 느린 화학적 전략을 우회하여 신경 돌기 성장을 유도합니다. 여기에 제시된 예비 측정은 생리 학적 성장 속도를 훨씬 초과하는 연결 성장 속도를 보여줍니다. 이러한 혁신을 결합하면 전례없는 수준의 제어력으로 문화의 신경 네트워크를 정확하게 구축 할 수 있습니다. 뉴런 네트워크의 신호 전송과 의사 소통에 대한 많은 정보와 통찰력뿐만 아니라 연결 성장의 한계를 탐구하는 놀이터이기도 한 새로운 방법입니다. 잠재적 인 응용 및 실험은 신경 세포를 다시 연결하는 것을 목표로하는 치료법에 직접적인 영향을 미치며 널리 퍼져있다외상 후 또는 신경 퇴행성 질환에서 l 회로.
Introduction
성인 중추 신경계 (CNS)에 부상을 입으면 축삭 재성장을 제한하는 여러 메커니즘으로 인해 영구적 인 장애가 발생할 수 있습니다 1 . 손상 후 많은 CNS 축색 돌기가 새로운 성장 원추를 형성하지 못하고 효과적인 재생 반응 2를 일으키지 못합니다. 또한, CNS 병변을 둘러싼 손상 및 흉터 조직은 axonal 성장을 크게 억제 1,2,3 . 손상 후 CNS 재생을 촉진시키는 현재의 치료법은 부상당한 뉴런의 본질적인 성장 잠재력을 높이고 myelin 파편과 glial scar 1 , 3 과 관련된 axonal extension의 억제제를 마스킹하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 먼 축삭을 먼 표적으로 재생시키고 적절한 기능 시냅스를 형성하는 능력은 심각하게 제한되어있다 . </sup> 5 , 6 , 7 .
현재 연구에서, 마이크로 비드, 피펫 마이크로 조작 및 마이크로 유체 장치는 장거리에서 새로운 기능적 신경 회로를 신속하게 개시, 연장 및 정확하게 연결하는 데 사용됩니다. 이전 연구는 poly-D-lysine-coated beads (PDL- 비드)가 시냅스 소포 복합체의 클러스터링과 기능적인 시냅스 전처리 8의 형성에 이어 막 접착을 유도한다는 것을 보여 주었다. PDL- 비드가 시냅스 전 분화 후에 기계적으로 제거되면 시냅스 단백질 군집이 비드를 따라 가면서 새로운 신경 돌기 9를 시작한다는 것도 보여 주었다. 다음 절차는 polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic 장치를 사용하여 coverslip에 조직화 된 영역으로 쥐의 배아 hippocampal 뉴런을 배양하여 신경 세포를 정확하게 재 연결하는 능력과 함께이 사실을 이용합니다회로.
이러한 PDMS 마이크로 유체 장치는 무독성이며 광학적으로 투명하며 마이크로 채널 시스템으로 연결된 두 개의 챔버로 구성됩니다. 일단 coverslip에 조립, 각 장치는 연결 성장을 유도 하고 체외에서 4 주 이상에 대한 정확한 패턴에 건강한 연결의 문화를 유지하기 위해 금형 역할을합니다.
여기, 새로운 신경 돌기의 확장과 기능의 한계를 조사하는 프레임 워크가 제시됩니다. 새로운 기능성 신경 돌기가 만들어져 신경 세포 네트워크를 제어 가능하게 (재) 배선 할 수 있습니다. 달성 된 확장 속도는 밀리미터 – 스케일 거리에서 20 μm / min보다 빠르며 기능적 연결이 확립됩니다. 이러한 결과는 예기치 않게 길항에 대한 이들 신경 돌기의 내재적 능력이 이전에 생각했던 것보다 훨씬 빠르다는 것을 보여준다. 이 제안 된 기계적 접근법은 느린 화학 전략을 우회하고 특정 타겟에 대한 제어 된 연결을 가능하게합니다. Th기술은 손상 후 신경 연결성을 복원하기위한 새로운 치료법에 대한 in vitro 연구를위한 새로운 방법을 제시합니다. 그것은 또한 시험 관내에서 신경 신호 처리 및 연결 기능의 근본적인 측면을 조사하기 위해 신경 네트워크의 조작 및 재배 선을 가능하게합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
표준 micromanipulation과 혁신적인 microfluidic 장치를 사용하여, 새로운 기술은 빠른 거리에서 새로운 기능적 신경 회로를 신속하게 시작, 연장 및 연결하기 위해 개발되었습니다. 피펫 micromanipulation은 대부분의 신경 과학 연구소 4 , 13 에서 일반적인 도구입니다. 재현성 있고 신뢰할 수있는 결과를 얻기위한 실질적인 과제는 마이크로 미터 정밀도의 세포 배?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
많은 도움이되는 토론과 통찰력을 얻으려는 요요이 미야하라 (Yoichi Miyahara)에게 감사드립니다. MA와 PG는 NSERC로부터 자금 지원을 인정합니다.
Materials
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
Referenzen
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