Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em> Drosophila</emPhotoreceptors
Summary
Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar.
Abstract
Drosophila melanogaster fotoreseptörlerinden alınan tüm hücre voltaj kelepçesi kayıtları, inositol-lipid sinyal verme ve Geçici Alıcı Potansiyel (TRP) kanallarını tek molekül seviyesinde incelemek için D. melanogaster moleküler genetiğin kullanılmasını sağlayan omurgasız görsel transdüksiyon alanını devrim yarattı. Bir avuç laboratuvar, yüksek kontrollü koşullardaki ışığa fizyolojik cevapların analizini sağlayan bu güçlü tekniği hakimiyet altına almıştır. Bu teknik, hücre içi ve hücre dışı ortamları kontrol etmeye izin verir; Membran voltajı; Ve çeşitli iyonik veya pH indikatörleri gibi farmakolojik bileşiklerin intra-ve hücre dışı medyaya hızlı uygulanması. Son derece yüksek bir sinyal-gürültü oranı ile bu yöntem, karanlık kendiliğinden ışığa neden olan üniter akımları ( örn. Spontan ve kuantum darbe) ve makroskopik Işık Tarafından Akıtan Akımları (LIC)Gle D. melanogaster fotoreseptörler. Bu protokol, hem elektrofizyolojik hem de optik kayıtları içeren bu tekniği gerçekleştirmek için gerekli olan tüm önemli adımları ayrıntılı bir şekilde özetlemektedir. Hamam odasında sağlam ve uygulanabilir ex vivo izole ommatidia elde etmek için sinek retina diseksiyon prosedürü anlatılmıştır. Tüm hücre ve floresan görüntüleme ölçümlerini gerçekleştirmek için gerekli ekipman da detaylandırılmıştır. Son olarak, uzun deneyler sırasında bu hassas preparatın kullanımındaki tuzaklar açıklanmaktadır.
Introduction
100 yıldan fazla bir süre önce başlatılan Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) meyve sineği genetik çalışmaları, karmaşık biyolojik süreçlerin genetik diseksiyonu için son derece faydalı bir deney modeli olarak D. melanogaster sinekini kurdu. Aşağıda açıklanan metodoloji, D. melanogaster moleküler genetiğin birikmiş gücünü, tüm hücre yaması tutam kayıtlarının yüksek sinyal-gürültü oranı ile birleştirmektedir. Bu kombinasyon hem doğal ortamda hem de tekli moleküllerin en yüksek çözünürlüğünde inositol-lipit sinyallemesi ve TRP kanal düzenleme ve aktivasyonunun bir modeli olarak D. melanogaster fototransdüksiyonunun incelenmesine olanak tanır.
Tüm hücre kayıt yönteminin D. melanogaster fotoreseptörlerine uygulanması, omurgasız fototransdüksiyon çalışmalarında devrim yarattı. Bu yöntem Hardie 1 ve bağımsız olarak geliştirilmiştir.Sonsuza dek Ranganathan ve meslektaşları tarafından 2 ila 26 yıl önce ve D. melanogaster'ın geniş genetik manipülasyon araçlarından istifade etmek ve bunları fototransdüksiyon ve inositol-lipid sinyalizasyon mekanizmalarını ortaya çıkarmak için kullanmak üzere tasarlandı. İlk başta, bu teknik, detaylı niceliksel çalışmaları engelleyen, diseksiyon işlemi sırasında ışık hassasiyetinde hızlı bir düşüş ve ommatidia düşük bir hasar gördü. Daha sonra, yama pipetine ATP ve NAD ilavesi, preparatın uzun süreli niceliksel kayıtlar için uygunluğunu önemli ölçüde artırdı. Bundan sonra, moleküler düzeyde sinyal iletim mekanizmasının kapsamlı karakterizasyonu gerçekleştirildi.
Halen, D. melanogaster fototransdüksiyonu, fosfoinositid sinyali ve TRP kanallarının tek molekül çözünürlüğünde ex vivo incelenebildiği az sayıdaki sistemden biridir. Bu, D. melanogasterin fototransdüksiyonunu yapar ve benBu mekanizmayı oldukça hassas bir model sistem olarak incelemek için geliştirilen trodoloji. Bu protokol, D. melanogaster retinanın ayrıştırılacağını ve çevredeki pigment (glia) hücrelerinden izole edilmiş ommatidiyi mekanik olarak soyduğunu açıklamaktadır. Bu, fotoreseptör hücre gövdeleri üzerinde bir giga sızdırmazlık elemanı ve bir tam hücre yama kelepçesi oluşumunu mümkün kılar. Neyse ki, en sinyal veren proteinler rabdomere ile sınırlıdır ve yayılmaz. İlaveten, sinyal bölmesi ile hücre gövdesi 3 , 4 arasında bulunan kalphotin adı verilen hareketsiz bir Ca 2+ tamponu ve mikrovillide Na + / Ca 2+ eşanjörünün (CalX) yüksek ekspresyon seviyesi vardır 5 . Birlikte, rhabdomere'ye protein salıverme, calphotin tamponu ve CalX'in yüksek ekspresyonu, gerekli bileşenlerin kaybı olmadan nispeten uzatılmış (yaklaşık ~ 20 dk'ya kadar) tüm hücre kayıtlarına olanak tanırVe ışığa karşı yüksek duyarlılığı korurken. Aşağıdaki protokol izole ommatidia'yı nasıl elde edeceğinizi ve fototranskülasyon kaskadının yerli özelliklerini koruyan tüm hücre kayıtlarını nasıl yapacağınızı açıklamaktadır. Ayrılmış hamam böceği ( Periplaneta americana ) 6 ve kriket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia üzerinde D-melanogaster için tarif edilene benzer şekilde tam hücre yama kelepçe deneyleri yapıldı . Ek olarak, file clam ( Lima scabra ) ve tarak ( Pecten irradians ) ayrıştırılmış fotoreseptörleri üzerindeki patch clamp deneyleri D. melanogaster üzerinde gerçekleştirilenlerden biraz daha farklı bir şekilde gerçekleştirildi , hem tüm hücre 8 hem de tek kanallı ölçümler yapıldı 9 . Burada, D. melanogaster'te bu tekniği kullanarak elde edilen başlıca başarılar anlatılmaktadır. Tartışma iBu tekniğin bazı tuzakları ve kısıtlamaları tanımını içermez.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm hücre kayıtlarının D. melanogaster fotoreseptörlerine uygulanması TRP kanalları 27 , 28 , 29 ve INAD 30 , 31 , 32 iskele proteini gibi yeni sinyal proteinlerinin keşfedilmesine ve işlevsel aydınlatılmasına izin verdi. Bu tekniğin ilk tanıtımından bu yana, ışık tepkisinin iyonik mekanizması ve voltaja bağımlılığı ile ilgili uzun vadeli temel soruları çözdü. Bu, zar voltajını ve hücre dışı ve hücre içi iyonik kompozisyonu 19 , 28 doğru bir şekilde kontrol etme konusundaki yeteneği nedeniyle meydana geldi.
D. melanogaster'deki yama sıkıştırma tekniğinin büyük bir engeli izole ommatidia prepa'nın kırılganlığı olmuşturrasyon. Ayrıntılı çalışmalar, phototransduction makinelerinin bütünlüğünün, özellikle ATP'nin büyük bir tüketimine yol açan, ışık maruziyeti sırasında, ATP'nin kesintisiz beslenmesine eleştirel olarak bağlı olduğunu ortaya koymuştur. Ne yazık ki, yama pipeti ile fotoreseptör zarına ulaşmak için gerekli olan pigment ( yani glia) hücrelerinin mekanik olarak çizilmesi, ATP üretimi için gerekli metabolitlerin ana kaynağını ortadan kaldırmaktadır 33 . Harici ATP'nin kayıt pipetine uygulanması, büyük oranda ATP gereksinimini kısmen yerine getirmektedir. Kısa bir ATP kaynağı, TRP kanallarının kendiliğinden aktivasyonuna ve ışık aktive kanallardan fototransdüksiyon mekanizmalarının ayrışmasına yol açar, bu da hücresel Ca2 + ' da büyük bir artışa ve normal tepkinin 34 , 35'e ortadan kalkmasına neden olur. Bu olaylar dizisi,Fotoreseptörlere, aksine de ATP'nin hücresel tükenmesine yol açar. Bu olayların meydana gelmesini önlemek ve normal ışık tepkileri sağlamak için, fotoreseptörler, yoğun ATP ışıklarını tüketen yoğun ışıklara maruz bırakılmamalıdır. Ayrıca, muhtemelen mitokondriyumda ATP üretimini kolaylaştırmak için NAD, kayıt pipetine dahil edilmelidir 18 , 36 . Spontan ve kuantum tümseklerin ölçümleri için yukarıdaki zorluk minimumdur, çünkü yalnızca loş ışıklar kullanılır. Uygulamada, kararlı bir tam hücreli kayıt ~ 20-25 dakika süreyle muhafaza edilebilir, ancak tepki kinetiği bu süre zarfında yavaşlama eğilimi gösterir. Ayrışmış ommatidia'nın tek bir preparatı 2 saate kadar kullanılabilir kalabilir.
İzole edilen ommatidia preparasyonunun ek bir eksikliği, mikropların erişilememesidir ve bu da TRP'ye erişilememesine veTRPL kanallarını kayıt pipetine koyarak tek kanallı kayıtları engeller. Geliştirdikleri bir yöntemle Bacigalupo ve meslektaşları, doğrudan rhabdomere 37'den tek kanallı etkinlik kaydetmeyi başardı. Bununla birlikte, bu kanal aktivitesi, doku kültürü hücrelerinde heterolog olarak ifade edilen TRPL kanallanndan ve izole ommatididen elde edilen atımlı ses analizinden türetilen TRP kanal aktivitesinden farklıdır 34 . Muhtemelen disseksiyon prosedürü bu yöntemi kullanırken fotoreseptör hücrelerine büyük zarar vermiştir.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırmanın deneysel kısmı ABD-İsrail Bi Ulusal Bilim Vakfı (BM ve IL'ye), İsrail Bilim Vakfı (ISF), Deutsch-İsrail Projeksiyon İşlemi (DIP) (BM'ye) ve Biyoteknoloji Ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC Hibe Numaraları: BB / M007006 / 1 ve BB / D007585 / 1) RCH'ye
Materials
| 10 ml syringe | |||
| 5 ml syringe | |||
| 1 ml syringe with elongated tip | |||
| Petri dish | 60 mm | ||
| Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
| Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
| 2 small beakers | 50 ml or less | ||
| 2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
| Bath chamber | home made | ||
| Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
| Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
| Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
| Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
| Micro dissecting needle holder | |||
| Vise | |||
| 2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
| Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
| Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
| Osilloscope | GW | GOS-622G | |
| Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
| Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
| Suction system | |||
| Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
| Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
| Clampex | Molecular Device | 10 | software |
| pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
| Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
| Light detector | home made | phototransistor | |
| Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
| Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
| Light guide | Quartz | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
| Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
| Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
| Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
| CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
| NIS Element | Nikon | AR | software |
| Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
| Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
| Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
| Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |
Referenzen
- Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).
- Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
- Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).
- Weiss, S., et al. Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration. J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).
- Wang, T., et al. Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX. Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).
- Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation. J. Physiol. Lond. 440, (1991).
- Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).
- Nasi, E. Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra. J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).
- Nasi, E., Gomez, M. P. Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians. J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).
- Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).
- Kohn, E., et al. Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo. J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).
- Hevers, W., Hardie, R. C. Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors. Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).
- Scott, K., Zuker, C. S. Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses. Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).
- Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors. J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).
- Katz, B., Minke, B. Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors. J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).
- Hardie, R. C., et al. Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase. Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).
- Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL. Neuron. 19, 1249-1259 (1997).
- Liu, C. H., et al. In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel. J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).
- Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O’Tousa, J. E. Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Liu, C. H., et al. Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III. Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).
- Cook, B., et al. Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo. Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).
- Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).
- Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).
- Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
- Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
- Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).
- Shieh, B. H., Niemeyer, B. A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila. Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina. J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).
- Hardie, R. C., Minke, B. Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).
- Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).
- Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
- Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Parnas, M., Katz, B., Minke, B. Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel. J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).
