JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Automatische Übersetzung
Neurowissenschaften

Elektrofysiologisk metode for helcelle spenningsklemmeopptak fra<em> Drosophila</em> Fotoreseptorer

Published: June 13, 2017
doi:
10.3791/55627
, , , ,
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC),Hebrew University, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience,University of Cambridge

Summary

Hele celleopptak fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer muliggjør måling av spontane mørke støt, kvantesprengninger, makroskopiske responser på lys og strømspenningsforhold under forskjellige forhold. I kombinasjon med D. melanogaster genetiske manipulasjonsverktøy, muliggjør denne metoden studien av allestedsnærværende inositol-lipid signalveien og dens mål, TRP-kanalen.

Abstract

Hele-celle spenningsklemmeopptak fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer har revolusjonert feltet for invertebrat visuell transduksjon, som muliggjør bruk av D. melanogaster molekylær genetikk for å studere inositol-lipid signalering og transientreceptor potensielle (TRP) kanaler på enkeltmolekylnivå. En håndfull laboratorier har mestret denne kraftige teknikken, som gjør det mulig å analysere de fysiologiske responsene på lys under høyt kontrollerte forhold. Denne teknikken tillater kontroll over intracellulære og ekstracellulære medier; Membran spenningen; Og hurtig påføring av farmakologiske forbindelser, slik som en rekke ioniske eller pH-indikatorer, til intra- og ekstracellulære medier. Med et unikt høyt signal-støyforhold, gjør denne metoden muligheten for å måle mørke spontane og lysinducerte enhedsstrømmer ( dvs. spontane og kvanteboller) og makroskopiske lysinducerte strømmer (LIC) fra syndGle D. melanogaster fotoreceptorer. Denne protokollen skisserer i stor detalj alle de viktigste trinnene som er nødvendige for å utføre denne teknikken, som inkluderer både elektrofysiologiske og optiske opptak. Flytthemningsdiseksjonsprosedyren for å oppnå intakt og levedyktig isolert ommatidia fra ex vivo i badekammeret er beskrevet. Utstyret som trengs for å utføre helcelle- og fluorescensbilder målinger er også detaljert. Til slutt forklares fallgruvene ved bruk av dette delikate preparatet under utvidede eksperimenter.

Introduction

Omfattende genetiske studier av fruktfluen , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , initiert for over 100 år siden, har etablert D. melanogasterfly som en ekstremt nyttig eksperimentell modell for genetisk disseksjon av komplekse biologiske prosesser. Metodologien beskrevet nedenfor kombinerer den akkumulerte kraften til D. melanogaster molekylærgenetikk med det høye signal-til-støyforholdet mellom helcelle patch clamp-opptak. Denne kombinasjonen tillater studiet av D. melanogaster- fototransduksjon som en modell for inositol-lipid-signalering og TRP-kanalregulering og -aktivering, både i det opprinnelige miljøet og ved den høyeste oppløsningen av enkle molekyler.

Anvendelse av helcelleopptaksmetoden til D. melanogaster fotoreceptorer har revolusjonert studiet av invertebratfototransduksjon. Denne metoden ble utviklet av Hardie 1 og indepEndelig av Ranganathan og kolleger for 2 ~ 26 år siden, og ble designet for å utnytte de omfattende genetiske manipulasjonsverktøyene til D. melanogaster og bruke dem til å avdekke mekanismer for fototransduksjon og inositol-lipid-signalering. I begynnelsen led denne teknikken av en rask reduksjon i lysfølsomhet og lavt utbytte av ommatidia under disseksjonsprosessen, som forhindret detaljerte kvantitative studier. Senere økte tilsetningen av ATP og NAD til patchpipetten dramatisk økt preparatets egnethet for langvarige kvantitative innspillinger. Deretter ble omfattende karakterisering av signaltransduksjonsmekanismen på molekylnivå realisert.

For tiden er D. melanogaster fototransduksjon et av de få systemene der fosfonositidsignalering og TRP-kanaler kan studeres ex vivo ved enkeltmolekyloppløsning. Dette gjør D. melanogaster phototransduction og megThodology utviklet for å studere denne mekanismen et svært følsomt modell system. Denne protokollen beskriver hvordan du dissekerer D. melanogaster retina og mekanisk striper den isolerte ommatidien fra de omkringliggende pigment (glia) cellene. Dette gjør det mulig å danne en giga-tetning og en helcelle patch klemme på fotoreceptor celle legemer. Heldigvis er de fleste signalproteiner begrenset til rhabdomeren og diffunderer ikke. I tillegg er det en immobile Ca 2+ buffer kalt calphotin, plassert mellom signalkammeret og cellekroppen 3 , 4 og et høyt ekspresjonsnivå av Na + / Ca 2+ -veksleren (CalX) i mikrovilli 5 . Sammen gir proteininnholdet til rhabdomeren, kalphotinbufferen og det høye uttrykket av CalX relativt langvarig ( dvs. opptil ~ 20 min) helcelleopptak, uten tap av essensielle komponenterAv fototransduksjonsprosessen og samtidig opprettholde høy følsomhet for lys. Følgende protokoll beskriver hvordan man får tak i isolert ommatidia og utfører helcelleopptak som ser ut til å bevare fototransduksjonskaskadets innfødte egenskaper. Hele-celle patch clamp eksperimenter på dissociated kakerlakk ( Periplaneta americana ) 6 og cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia ble utført tilsvarende som beskrevet for D. melanogaster . I tillegg ble patch clamp-eksperimenter på dissocierte fotoreceptorer av filen clam, ( Lima scabra ) og kamskjell ( Pecten irradians ) utført på en litt annen måte enn den som ble utført på D. melanogaster , slik at både helcelle 8 og enkeltkanalmålinger 9 . Her beskrives de store prestasjonene som er oppnådd i D. melanogaster ved anvendelse av denne teknikken. Diskusjonen iInkluderer beskrivelse av noen fallgruver og begrensninger av denne teknikken.

Protocol

1. Reagenspreparasjon MERK: Forbered alle løsninger i henhold til instruksjonene i tabell 1-4 . Fyll en 10 ml sprøyte med ekstracellulær løsning (ES eller ES-0Ca 2+ , etter behov, se tabell 1 ) og hold den på is. Forbered ett hetteglass med Trituration Solution (TS, se Tabell 2 , dvs. ES eller ES-0Ca 2+ + FBS og sukrose) og hold dette på is. Forbered tilstrekkelig ES for forsøket og hold det på is til behov. MERK: Kontinuerlig bad perfusjon er ikke nødvendig, så volumet av ES trenger ikke mer enn noen få dusin ml. Bruk en 22 μm PVDF filter, last den intracellulære løsningen (se Tabell 3 eller Tabell 4 ) i en 1 ml sprøyte med en elektrodefylling langstrakt spiss. Hold dette på is. 2. Generell oppsett av Dissecting Tools <p class="Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figur 1: Verktøy og enheter som trengs for å gjøre den isolerte Ommatidia-preparatet. Bildene viser de forskjellige enhetene som kreves for å lage det isolerte ommatidiapreparatet, som beskrevet i den detaljerte protokollen ovenfor. To bjelker, en fylt med vann ( A ) og den andre fylt med etanol ( B ) for rengjøring av tritureringspipettene ( D ), som er forbundet med slangen ( C ). Disseksjonsverktøyene er: 2 par fine og 1 par grove pinsetter ( F ) og en retina scooper ( E ). For å forberede retina scooper, trykkes en mikrotissjonsnål ( H ) mellom to dreieverktøy som fungerer som en skrue ( G ) for å flate toppen av nålen ( I ). Da er det koblet til en langstrakt pi Ece av metall ved hjelp av lim ( J ) og montert på en nålholder ( E ). Razorbladbrikke og holder: Ta av og fest en liten trekantet brikke med et knivblad med en knivbladholder ( K ). Disseksjons arbeidsområdet består av en kikkert ( L ) og en kul rød lyskilde (( M), ) med to lyskaster ( N ). Disseksjonsverktøyene, inkludert pinsett ( F ), retina scooper ( E ), bjelker ( A og B ), lommelykt med rødt filter ( Q ) og delikate viskere ( R ) er plassert på begge sider av kikkerten. En isbøtte med ES, FBS-ES, intracellulære løsningssprøyter, 60 mm petriskålen ( S ) og elektrodeholderen ( P ) er også plassert på bordet. Innspillingselektrodene trekkes ved hjelp av en horisontal trekker ( T ).E.com/files/ftp_upload/55627/55627fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Konstruer en retina scooper for å isolere retinae. Sett inn punktet (1-4 mm) av en mikro-disseksjonsnål (entomologisk nål, 12 mm lengde, 0,1 mm diameter) mellom de to skruene og flatt den ved å tappe med en liten hammer. Monter den flattede nålen på en mikro-dissesnålholder (se Materialebordet ). Ved hjelp av et par pinsetter, kurver du den flattede enden av nålen for å danne en krok med en krumning på ~ 2,5 mm. Lag triturering pipetter for ommatidia separasjon. Plasser en glassplate på 1,2 x 0,68 mm (OD x ID) over en åpen flamme og brannpolere det for å redusere åpningen. Mål størrelsen på kapillæråpningen under et mikroskop. Sorter de opprettede ommatidiale triturasjonspipettene i seveN grupper i henhold til åpningens størrelse ( dvs. 0,2-0,5 mm). Oppbevar dem i separate egnede beholdere ( f.eks. Rør). Fyll ett lite beger med dobbeltdestillert vann (DDW) og et annet lite beger med etanol 70%. Dekk hvert bæger med et parafinfilmark. Punch et lite hull i parafinfilmarket som dekker DDW-begeret (se figur 1A ). Punch syv små hull i parafinfilmarket som dekker etanylbeholderen og nummer hullene fra 0 til 6 (se figur 1B ). Plasser en ommatidisk tritureringspipett fra hver størrelsesgruppe i hvert parafinfilmhull, slik at pipetten med den største åpningen er plassert i 0 hullet og pipetten med den minste åpningen er plassert i 6. hullet. Koble en 200 μL pipettspiss av plast til en 35 cm lang, 1,57 x 1,14 mm (OD x ID) stykke polyetylenrør. connecT den andre enden av slangen til en av de ommatidiale triturasjonspipettene med den største åpningen ( dvs. 0,46 – 0,5 mm), slik at den spisse enden av tritureringspipetten ikke vender inn i slangen. Klargjør pipetter med helcelleopptak ved å trekke patch clamp pipetter fra et 1 x 0,58 mm (OD x ID) borosilikatfilament som inneholder glasskapillærer. MERK: Motstanden til pipettene skal være 8-15 MΩ ved bruk av kaliumglukonatbasert intracellulær løsning (IS1). Enhver egnet patchpipettdrakker kan brukes (for eksempel se Materialebordet ). Brannpolering er ikke nødvendig. Klargjør et opptakskammer (se figur 2 ) ved å feste et deksel (se Materialetabell ) til bunnen av badekammeret ved å bruke smeltet paraffin eller høyvakuum silikonfett . Bruk ethvert egnet hjemmelaget eller kommersielt kammer som tillater elektrodtilgang og perfusjon. Monter badet på scenen av et invertert mikroskop. Plasser perfusjonssystemet, sugesystemet og bakken ( dvs. Ag-AgCl wire / pellet) i badekaret (se Materialebordet og Figur 2 ). Plasser to par fine # 5 pincett ( figur 1 ) på arbeidsflaten for bruk under retina disseksjon og ommatidia isolasjonstrinn. 3. D. melanogasterbearing Raise D. Melanogaster flyr med lav befolkningstetthet ( dvs. ~ 20 flyr i en 6 oz flaske) i flasker som inneholder standard cornmeal mat ved 19-24 ° C. MERK: Det er å foretrekke å arbeide med mørke tilpassede fluer. For å opprettholde høy følsomhet mot lys, redusere mangfoldet og forhindre retinal degenerasjon i mutant fluer. Bak flyene i mørket i minst 24 timer før forsøket. MERK: Flyvene som brukes til forsøkene, skal være mottattNtly eclosed (<2 h) og fortsatt myk, blek vise meconium. ommatidia kan også lett fremstilles fra pupper, selv om deres følsomhet overfor lys er så sterkt avhengig av alder 10 . 4. retina disseksjon isolasjon: alternativ 1 merk: utfør alle de følgende trinnene under stereoskopisk zoommikroskop ved hjelp en forsterkning som egnet for å se preparatet korrekt (se figur ). plasser fire dråper es-0ca 2+ dråpe ts-løsning på 60 mm petriskål blitt slått over. grove pincet, ta nylig lukket (<2 timer etter eclosion) fly med vingene eller kroppen. dette punktet prosedyrer raskt svak rød belysning 20 ± ° c. mens du likevel griper fluen pincettene, bruker det første par fine pincett til løsne flyhodet submerge hodet i den dråpen. dissekter halvveis langs sagittalplanet andre pinsetter. sørg at begge øynene slutten trinnet intakte. overfør halvparten dråpen halvdelen tredje bruk pincetene, fjern mye vevet omgir øyet mulig, ikke blir skader netthinnen. tak kanten hornhinne pincettene skru ut scooperen. fullføring vil hornhinnen bli tom intakt, skilt intakt retina. skyll triturasjonspipetten koblet slangen ddw fyll pipetten liten mengde fjerde må utføres hver gang ny ommatidia-separerende pipette brukes fjernes fram etanolbjelken (løsningen fyller bør samsvare løsningen der netthinnen nedsenket). sug forsiktig opp munnen trekke isolerte inn pipetten. ekstrem forsiktighet streve luftbobler ts. 4.6-4.10 også. tørk dråpene delikate kluter, la kun ts inneholder retinae petriskålen. legg seks flere toppen retinas ts-dråpene. bytt triturering mindre diameter åpning. beskrevet trinn 4.8, fylle aspirer utløp hurtig gjentatt oppløsningen begynne separasjonen isolert strippet pigmentceller hele ommaentidia synlig ts-dråpen, ettersom isolasjonsprosessen utvikler seg, ts-dråpet gjennomsiktig. gjenværende neste ts-dråpe. tidligere ts-dråpen (inneholder ommatidiaen) badkammeret. gjenta 4.12-4.14 oppnå maksimal ommatidia. vent ca min synke binde bunnen badekammeret. bruke perfusjonssystemet, start strømmen 1,5 kammeret fullstendig fylt løsningen, bunn topp, bakken helt nedsenket løsningen. fortsett vaske badet 4-5x. 5. 2 zoommikroskop, amplifiksering visning klargjør et knivblad holder. bryt fest trekantet flis knivbladholder ( forbered silikondisseksjonskål >

Representative Results

Den beskrevne metoden har muliggjort nøyaktig registrering av de grunnleggende enhedsstrømmene som genererer spontane og lette fremkallede kvantebud, som summer for å produsere makroskopisk respons på lys under definerte betingelser. Det tillot også sammenligning mellom wildtype og mutant fluer som har defekter i kritiske signalmolekyler ( figur 3 og 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . I tillegg viste evnen til å måle reverseringspotensialet under bi-ioniske forhold grunnleggende biofysiske egenskaper av TRP- og TRP-lignende (TRPL) -kanalene 18 , 19 . Det muliggjorde også måling av effektene av aminosyresubstitusjoner i porregionen av TRP som modifiserte dens Ca 2+Permeabilitet 20 . Lysresponsen som oppnås ved patch clamp-helcelleopptak, avhenger lineært på lysintensiteten for minst 4 størrelsesordener. Dette kunne ikke løses ved å bruke ERG og intracellulære opptaksmetoder. Følgelig viste en serie svar på korte blinker av økende intensitet og et plott av intensitetsresponsfunksjonen en streng linearitet av blitsresponsen med økende lysintensitet. Den strenge lineæriteten holder opp til minst flere hundre pA, men det er diskutabelt om det etterfølgende er linearitet eller klemstyring som bryter ned ( figur 6 ). Disse resultatene antyder at makroskopiske responsene til lys er en lineær summering av de enhetlige responsene til lys ( dvs. kvantumstumper). Det har vært godt etablert ved hjelp av spenningsopptak som dim lysstimulering indUces diskrete spenningsfluktuasjoner ( dvs. kvantumstumper) hos de fleste ubeskyttede arter. D. melanogaster quantum bumps skyldes samordnet åpning av ~ 15 TRP kanaler og ~ 2 TRPL kanaler på toppen av bump 18 . Hver bump genereres av absorpsjonen av en enkelt foton, mens makroskopisk respons på mer intense lys er summasjonen av disse elementære svarene 14 , 21 . Bumpene varierer betydelig i latens, tidskurs og amplitude, selv når stimulusforholdene er identiske. Bump generasjon er en stokastisk prosess beskrevet av Poisson statistikk, hvor hver effektivt absorbert foton utløser bare en bump. Enkeltfoton-enkelt-bunkeforholdet krever at hvert trinn i kaskade ikke bare inneholder en effektiv "på-på" -mekanisme, men også en like effektiv "avstengningsmekanisme". Den funksjonelle fordelen er produksjonen av aMeget sensitiv foton counter med en rask forbigående respons som er svært godt egnet for både følsomheten og den tidsmessige oppløsningen som kreves av det visuelle systemet. Kravet på en effektiv avviklingsmekanisme blir avslørt når enten den aktive fotopigmentet ( dvs. metarhodopsin, M) eller dens mål, G q α, ikke deaktiverer og fører til kontinuerlig produksjon av støt lenge etter at lyset er slått av ( Figur 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . Bumpen representerer samvirkeaktiviteten til TRP / TRPL-kanalene i en mikrovillus. Som sådan bør enhver hypotese av kanalaktivering også forklare kooperativ kanalaktivering. Nylig har Hardie og kolleger vist at lys fremkaller raske sammentrekninger av fotoreceptorene, noe som tyder på at lysfølsomhetenE kanaler (TRP / TRPL) kan være mekanisk inngjerdet 25 . Denne mekaniske aktiveringen, sammen med de observerte protonene utgitt av PLC-mediert PIP 2- hydrolyse, fremmer åpningen av TRP / TRPL-kanalene og forklarer kooperativ naturen av støpproduksjonen 26 . Foreløpig er D. melanogaster fotoreceptorer et av de få systemene der fosfonositidsignalering og TRP-kanaler kan studeres in vivo , og dermed gjør D. melanogaster- fototransduksjon og metodikken utviklet for å studere denne mekanismen et svært verdifullt modellsystem. Figur 3: InaC P209 og inaD P215 mutanter avslører langsom responsavslutning av makroskopisk respons til lys og av enkeltkvantum-støt. ( A ) Den isolerte ommatidiumprepaRasjon med en patchpipette fylt med fluorescerende Lucifer Yellow CH-fargestoff (eksitasjon: 430 nm, emisjon: 540 nm) presenteres under en helcelleopptak. Merk at det fluorescerende fargestoffet diffunderte og merket en enkelt fotoreceptorcellelegeme, og at fotoreceptorcellelegemene løsnes fra deres langstrakte axoner, men fortsatt opprettholder levedyktighet. Dette preparatet er egnet for samtidige helcelleopptak og imagingeksperimenter. ( BD ) Øvre paneler: Hele-celle spenning klemmet kvantum bump responser til kontinuerlig dim lys (åpen bar) i WT, inaC P209 , og inaD P215 mutant fluer. En langsom avslutning av humpene observeres i inaC P209 og inaD P215 mutanter i forhold til WT fluer. Innlegget nedenfor viser den forstørrede formen av enkelte støt. Bunnpaneler: Normaliserte helcelle registrerte makroskopiske svar på en 500 ms lyspuls (1,5 x 10 5 fotoner per s) av ovennevnte wildtype Og mutant fluer. (EG) Øvre paneler: Hele-celle spenningsklemme kvantesporresponser på et kort (1 ms), svakt lys fremkallende enkeltfotonsvar i wildtype , arr2 3 og ninaC P235 mutantfluer . Legg merke til togstumpen observert i arr2 3 og ninaC P235 mutant fluer som følge av en enkelt fotonabsorpsjon. Bunnpaneler: Hele-celle spenning klemmet normaliserte responser på en 500 ms lyspuls (1,5 x 104 fotoner / s) i de tilsvarende mutantene. Legg merke til den langsomme avslutningen av de makroskopiske svarene som observeres i punkt 2 Og ninaC P235 mutant fluer i forhold til WT. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. D / 55627 / 55627fig4.jpg "/> Figur 4: Cellulær Ca 2+ -dynamikk Følgende signalfremkalt Ca 2+ -tilstrømning påvirkes av Calphotin. En tidsserie av fotoreceptorbilder av wildtype og Cpn 1% fluer som viser fluorescensen av Ca 2+ -indikatoren under lysstimulering. Råintensitetsbilder plottes ved bruk av falskfargekoding (bar = 10 μm; pilespisser angir pipetten). Figur utgitt med tillatelse fra Weiss et al. 4 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: De elektrofysiologiske egenskapene til WT-, trp- og trpl-mutanter. ( A ) Hele-celle spenningsklemme recoRdings av quantum bumps som svar på kontinuerlig dim lys (åpen bar) i WT, trpl 302 og trp P343 null mutant fluer. Sterkt reduserte amplituder av trp P34 3 observeres. Inset: Forstørrede enkeltkvantumstumper av wildtype og trp P343 null mutantfly er vist. ( B ) Hele-celle spenningsklemmeopptak som svar på en 3 s lyspuls av vildtype og de tilsvarende mutanter. Den forbigående steady-state responsen av trp P343 mutanten er observert . Inset: Forstørrede lysresponser av WT og trp P343 mutant er vist. ( C ) En familie av overliggende lysinducerte strømmer av ovennevnte flystammer, fremkalt som svar på en 20 ms lyspuls ved spenningstrinn på 3 mV målt rundt reverseringspotensialet (E rev ). ( D ) Et histogram som plottar den gjennomsnittlige E rev av wildtype og de forskjellige mutanenets. Feilbjelkene er SEM Vendingspotensialet (E rev ) for WT er mellom den positive E rev av trpl 302 , som kun uttrykker TRP, og E rev av trp P343 null mutanten, som bare uttrykker TRPL. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 6: Blitsresponsen er strengt lineær med økende lysintensitet. En serie av gjeldende svar på korte blinker av økende lysintensitet og et plott av avhengigheten av toppamplituden til lysresponsen på den økende intensiteten av korte lysblink. Dette forholdet viser en streng linearitet mellom flashresponsen og økende lysintensitet. Denne strenge lineæritetenHolder opp til minst flere hundre pA, med lysintensitet som spenner over 4 størrelsesordener, mens det er diskutabelt om det er linearitet eller klemstyring som bryter ned etterpå. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. pH- 7,15 (juster med NaOH) reagens Konsentrasjon (mM) NaCl 120 KCl 5 MgCl2 4 TES 10 Proline 25 alanin 5 Oppbevares ved -20 ° C. <td colspan= "2"> Merk: Denne løsningen er nominelt Ca 2+ fri, men har ingen Ca 2+ buffere tilsatt og vil derfor ha ca. 5 – 10 μM spor Ca 2+ . Ekstracellulær løsning (ES) = ES-0Ca 2+ med 1,5 mM CaCl2, fremstilt ved å tilsette CaCl2 fra en 0,5 eller 1 M stamløsning til ES-0Ca 2+ . Tabell 1: Ca + 2- fri ekstracellulær løsning (ES). Kjemisk beskrivelse og de spesifikke mengder som kreves for å produsere Ca + 2- fri ES. reagens Beløp FBS 15 ml sukrose 1,5 g Del i 150 μl alikvoter i 1,5 ml hetteglass og lagre ved -20 76; C. Trituration løsning (TS) Fyll 1 hetteglass med 150 ml stamløsning med 1,350 ml ES eller ES-0Ca 2+ , for å matche løsningen som ble brukt under disseksjonen. Tabell 2: Fetal bovint serum (FBS) + sakkarose-stamløsning. Kjemisk beskrivelse og de spesifikke mengder som kreves for å produsere fostre bovint serum (FBS) + sukrose-stamløsning. pH- 7,15 (juster med KOH) reagens Konsentrasjon (mM) Kaliumglukonat (Kglu) 140 MgCl2 2 TES 10 ATP magnesiumsalt (MgATP) 4 GTP natriumsalt (Na 2 GTP) 0.4 P-Nikotinamid-adenin-dinukleotidhydrat (NAD) 1 Oppbevares ved -20 ° C. Tabell 3: Intracellulær Solution (IS1). Kjemisk beskrivelse og de spesifikke mengder som kreves for å produsere IS1, som hovedsakelig brukes til intensitetsrespons og kvantemålinger. pH- 7,15 (juster med CsOH) reagens Konsentrasjon (mM) CsCl 120 MgCl2 2 TES 10 ATP magnesiumsalt (MgATP) 4 GTP natriumsalt (Na 2 GTP) 0.4 P-Nikotinamid-adenin-dinukleotidhydrat (NAD) 1 Tetra-etylammoniumklorid (TAE) 15 Oppbevares ved -20 ° C. Tabell 4: Intracellulær Solution (IS2). Kjemisk beskrivelse og de spesifikke mengdene som kreves for å produsere intracellulær løsning IS2, som hovedsakelig brukes til reverseringspotensielle målinger av den lysinducerte strømmen.

Discussion

Anvendelsen av helcelleopptak til D. melanogasterfotoreceptorer tillatt for oppdagelsen og funksjonell belysning av nye signalproteiner, slik som TRP-kanaler 27 , 28 , 29 og INAD 30 , 31 , 32 stillasprotein. Helt siden den innledende introduksjonen av denne teknikken gjorde det mulig å løse langsiktige grunnleggende spørsmål angående ionmekanismen og spenningsavhengigheten av lysresponsen. Dette skjedde på grunn av den tildelte evne til nøyaktig å kontrollere membranspenningen og den ekstracellulære og intracellulære ioniske sammensetning 19 , 28 .

Et stort hinder for patch-klemmeteknikken i D. melanogaster har vært skjønnligheten av den isolerte ommatidia preparasjon. Detaljert studier har vist at integriteten til fototransduksjonsmaskinen er avhengig av kontinuerlig tilførsel av ATP, spesielt under lyseksponering, noe som fører til et stort forbruk av ATP. Dessverre eliminerer den mekaniske stripingen av pigmentene ( dvs. glia) -cellene, som er nødvendig for å nå fotoreceptormembranet med patchpipetten, hovedkilden til metabolitter som er nødvendige for ATP-produksjon 33 . Påføring av eksogen ATP i opptakspipetten oppfyller kun delvis kravet til store mengder ATP. En kort forsyning av ATP fører til spontan aktivering av TRP-kanalene og til dissosiasjon av fototransduksjonsmaskinen fra de lysaktiverte kanalene, noe som forårsaker en stor økning i cellulær Ca 2+ og avskaffelse av normal respons på lys 34 , 35 . Denne rekkefølgen av hendelser skyldes ikke skade påFotoreceptorer ved disseksjonsprosedyren, men snarere til den cellulære uttømming av ATP. For å forhindre at denne hendelsessekvensen oppstår og for å opprettholde normale lysresponser, bør fotoreceptorene ikke bli utsatt for sterke lys, som bruker store mengder ATP. Også, NAD må inkluderes i opptakspipetten, antagelig for å lette ATP-produksjonen i mitokondriene 18 , 36 . For målinger av spontane og kvantesnor er ovennevnte vanskelighet minimal fordi bare dimlys brukes. I praksis kan en stabil helcelleopptak opprettholdes i ~ 20-25 minutter, selv om det er en tendens til responskinetikk å senke over denne perioden. Et enkelt preparat av dissocierte ommatidier kan forbli levedyktig i opptil 2 timer.

En ytterligere mangel på det isolerte ommatidiapreparatet er utilgjengeligheten til microvilli, som oversetter til utilgjengeligheten av TRP ogTRPL kanaler til opptakspipetten, for å hindre enkeltkanalinnspillinger. Ved hjelp av en metode de utviklet, lyktes Bacigalupo og kollegaer direkte å registrere enkeltkanalaktivitet fra rhabdomere 37 . Denne kanalaktiviteten er imidlertid forskjellig fra den for TRPL-kanaler heterologt uttrykt i vevskulturceller 38 og fra TRP-kanalaktivitet avledet fra skuddstøyanalyse oppnådd fra isolert ommatidia 34 . Formentlig har disseksjonsprosedyren skadet fotoreceptorcellene sterkt ved bruk av denne metoden.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Den eksperimentelle delen av denne undersøkelsen ble støttet av tilskudd fra USA-Israel Bi National Science Foundation (til BM og IL), Israel Science Foundation (ISF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (til BM), og bioteknologien Og Forskningsrådet for biologisk vitenskap (BBSRC Grant-tall: BB / M007006 / 1 og BB / D007585 / 1) til RCH

Materials

10 ml syringe
5 ml syringe
1 ml syringe with elongated tip
Petri dish 60 mm
Silicone dissection dish/block Dow Corning Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter 
Capillaries (for omatidia separation) Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)
Polyethylene Tubing Becton Dickinson 1.57 x 1.14 mm (35 cm)
 2 small beakers 50 ml or less
2 paraffin film sheets Parafilm M ~5 x 5 cm
Bath chamber home made
Cover slips 22 x 22 mm No. 0
Paraplast Plus Sigma Paraffin – polyisobutylene mixture To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber
Ground Warner Instruments  64-1288 Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly
Headless micro dissection needle Entomology, 12 mm
Micro dissecting needle holder
Vise
2 fine tweezers + 1 rough tweezers Dumont #5, Biology  0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox
Stereoscopic zoom Microscope  Nikon SMZ-2B
Cold light source Schott KL1500 LCD
Filter (Color) for cold light source Schott RG620
Delicate wipers Kimtech Kimwipes
Electrode holder Warner Instruments QSW-T10P Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style
Silver Wire Warner Instruments 0.25 mm diameter, needs to be chloridized
Micromanipulator Sutter Instruments MP 85 Huxley-Wall Style Micromanipulator
Faraday cage home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01
Osilloscope GW GOS-622G
Perfusion system Warner Instruments VC-8P Pinch valve control system
Perfusion valve controller Scientific instruments BPS-8
Suction system
Amplifier Molecular Device Axopatch-1D
Head-stage Molecular Device CV – 4 Gain: x 1/100
A/D converter Molecular Device Digidata 1440A
Clampex Molecular Device 10 software
pCLAMP Molecular Device 10 software
Light source (Xenon Arc lamp) Sutter Instruments Lambda LS
Light detector home made phototransistor
Filter wheel and shutter controller Sutter Instruments Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter
Filters (Natural density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElecftronic JML-C2
Light guide Quartz 
Pulse generator AMPI Master 8
Microscope Olympus IX71, Inverted
Red illumination filter (Microscope) RG630 / RG645 ø45mm
Microscope objective Olympus X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil
CCD Camera Andor iXon DU885K
NIS Element  Nikon AR software
Ca+2 indicator Invitrogen Calcium green 5N
Excitation & emission filters and dichroic mirror Chroma 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set
Vertical pipette puller Narishige  Model PP83 Use either vertical or horizontal puller, as preferred.
Horizontal pipette puller Sutter Instrument  Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller
Filament Sutter Instrument 3 mm trough or square box
Capillaries Harvard Apparatus borosilicate glass capillaries 1 x 0.58 mm
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).
  2. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  3. Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).
  4. Weiss, S., et al. Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration. J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).
  5. Wang, T., et al. Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX. Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).
  6. Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation. J. Physiol. Lond. 440, (1991).
  7. Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).
  8. Nasi, E. Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra. J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).
  9. Nasi, E., Gomez, M. P. Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians. J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).
  10. Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).
  11. Kohn, E., et al. Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo. J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).
  12. Hevers, W., Hardie, R. C. Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors. Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).
  13. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  14. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).
  15. Scott, K., Zuker, C. S. Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses. Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).
  16. Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors. J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).
  17. Katz, B., Minke, B. Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors. J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).
  18. Hardie, R. C., et al. Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase. Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).
  19. Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL. Neuron. 19, 1249-1259 (1997).
  20. Liu, C. H., et al. In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel. J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).
  21. Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O’Tousa, J. E. Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).
  22. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  23. Liu, C. H., et al. Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III. Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).
  24. Cook, B., et al. Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo. Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).
  25. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  26. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).
  27. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).
  28. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  29. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  30. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  31. Shieh, B. H., Niemeyer, B. A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila. Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).
  32. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  33. Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina. J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).
  34. Hardie, R. C., Minke, B. Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).
  35. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  36. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
  37. Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
  38. Parnas, M., Katz, B., Minke, B. Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel. J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).

Tags

Keywords: ElectrophysiologyWhole-cell Voltage ClampDrosophilaPhotoreceptorsPhototransductionTRP ChannelsVisual TransductionDissectionCalcium-free Extracellular SolutionInverted MicroscopePerfusion SystemSuction SystemGround WireElectrophysiology Setup
check_url/de/55627?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (124), e55627, doi:10.3791/55627 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image