전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em> Drosophila</em> 광 수용체
Summary
Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 – 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 – 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.
Abstract
Drosophila melanogaster 광 수용체의 전체 세포 전압 클램프 기록은 단일 분자 수준에서 이노시톨 – 지질 신호 및 과도 수용 수용체 (Transient Receptor Potential, TRP) 채널을 연구하기 위해 D. melanogaster 분자 유전학의 사용을 가능하게하는 무척추 동물 영상 전달 분야를 혁신했습니다. 소수의 연구실에서는이 강력한 기법을 익혔으며 고도로 제어 된 조건에서 빛에 대한 생리적 반응을 분석 할 수 있습니다. 이 기술은 세포 내 및 세포 외 매체를 제어 할 수 있습니다. 막 전압; 및 다양한 이온 성 또는 pH 지시약과 같은 약리학 적 화합물의 세포 내 및 세포 외 매체로의 신속한 적용을 포함한다. 예외적으로 높은 신호 대 잡음비로,이 방법은 어두운 자발적 및 광 유도 단일 전류 (자발적 및 양자 범프)와 거시적 인 빛 유도 전류 (LIC)를 죄로부터 측정 할 수 있습니다gle D. melanogaster 광 수용체. 이 프로토콜은 전기 생리 학적 및 광학적 기록을 모두 포함하는이 기술을 수행하는 데 필요한 모든 주요 단계를 아주 자세하게 설명합니다. 목욕실에서 손상되지 않고 생존 가능한 생체 외 고립성 구강 내막염 제거를위한 파리 망막 해부 절제술이 기술되었다. 전체 셀 및 형광 이미징 측정을 수행하는 데 필요한 장비도 자세히 설명합니다. 마지막으로, 확장 된 실험 동안이 섬세한 준비를 사용함에있어서 함정이 설명됩니다.
Introduction
약 100 년 전에 시작된 초파리 Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) 에 대한 광범위한 유전 연구는 D. melanogaster fly를 복잡한 생물학적 과정의 유전 적 해부를위한 매우 유용한 실험 모델로 확립했다. 아래에서 설명하는 방법은 D. melanogaster 분자 유전학의 누적 된 출력과 전체 셀 패치 클램프 녹음의 높은 신호 대 잡음 비율을 결합합니다. 이 조합은 네이티브 환경과 단일 분자의 최고 해상도 모두에서 이노시톨 – 지질 시그널링 및 TRP 채널 조절 및 활성화의 모델로서 D. melanogaster 광 변환의 연구를 허용한다.
D. melanogaster photoreceptors에 대한 전체 세포 기록 방법의 적용은 무척추 동물의 phototransduction에 대한 연구에 혁명을 일으켰습니다. 이 방법은 Hardie 1 과 indep가 개발했습니다.Ranganathan과 동료들에 의해 2 ~ 26 년 전에 끝내었고 , D. melanogaster 의 광범위한 유전자 조작 도구를 이용하고 phototransduction과 inositol-lipid signaling의 메커니즘을 밝히기 위해 사용되었다. 처음에는이 기술은 해부학 과정에서 빛 민감도가 급격히 감소하고 개복 수확량이 낮아 세부적인 정량 연구가 어려웠습니다. 나중에 패치 피펫에 ATP와 NAD를 첨가하면 장기간의 정량적 레코딩을위한 준비의 적합성이 크게 증가했습니다. 그 후, 분자 수준에서 신호 전달 메커니즘의 광범위한 특성이 실현되었다.
현재, D. melanogaster 광전 변환은 phosphoinositide 신호 및 TRP 채널이 단일 분자 분해능으로 생체 외에서 연구 될 수있는 몇 안되는 시스템 중 하나입니다. D. melanogaster 광전 변환과 저를 만듭니다 .thodology는이 메커니즘을 매우 민감한 모델 시스템으로 연구하기 위해 개발되었습니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 망막을 해부하고 주위 안료 (glia) 세포에서 분리 된 ommatidia를 기계적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 이것은 photoreceptor 세포 몸에 기가 씰과 전체 세포 패치 클램프의 형성을 가능하게합니다. 다행히 대부분의 신호 전달 단백질은 횡문근 막에만 국한되며 확산되지 않습니다. 또한 신호 구획과 세포 사이에는 칼포틴 (calciumphotin)이라고 불리는 움직일 수없는 칼슘 2+ 완충액이 있으며, 미포 질에서 Na + / Ca 2+ 교환기 (CalX)의 발현 수준이 높습니다. 함께 rhabdomere, calphotin 완충액 및 CalX의 높은 발현에 단백질 감금은 필수 구성 요소의 손실없이 상대적으로 연장 된 ( 즉 ~ 20 분까지) 전체 세포 녹음을 허용합니다빛에 대한 높은 감도를 유지하면서 광전도 공정의 다음 프로토콜은 고립 된 눈꺼풀 아래를 얻는 방법과 광 변환 캐스케이드의 고유 특성을 보존하는 것처럼 보이는 전체 세포 기록을 수행하는 방법을 설명합니다. 분리 된 바퀴벌레 ( Periplaneta americana ) 6 및 크리켓 ( Gryllus bimaculatus ) 7 외피에 대한 전체 세포 패치 클램프 실험은 D. melanogaster 에 대해 기술 된 것과 유사하게 수행 되었다. 또한 파일 클램프 ( 리마 scabra )와 가리비 ( Pecten의 irradians )의 dissociated photoreceptors에 대한 패치 클램프 실험은 전체 셀 8 및 단일 채널 측정을 허용 디 melanogaster 에 실시와 약간 다른 방식으로 수행되었다 9 . 여기,이 기술을 사용하여 디 melanogaster 에서 얻은 주요 업적이 설명되어 있습니다. 토론 나는이 기법의 몇 가지 함정과 한계에 대한 설명은 없습니다.
Protocol
1. 시약 준비 참고 : 표 1-4 의 지침에 따라 모든 솔루션을 준비하십시오. Extracellular Solution (ES 또는 ES-0Ca 2+ ; 필요에 따라 표 1 참조)과 함께 10 mL 주사기를 채우고 얼음 위에 보관하십시오. Trituration Solution (TS; 표 2 참조, 즉 ES 또는 ES-0Ca 2+ + FBS와 자당) 한 병을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 실험을위한 충분한 ES를 준비하고 필요할 때까지 얼음 위에서 유지하십시오. 참고 : 연속 목욕 관류가 필요하지 않으므로 ES의 부피는 수십 mL 이상이어야합니다. 22 μm PVDF 필터를 사용하여 전극 팁이 길게 뾰족해진 1 mL 주사기에 세포 내 용액을 넣으십시오 ( 표 3 또는 표 4 참조). 얼음 위에 올려 놓으세요. 2. 해부 도구의 일반 설정 <p class="jove_content"fo : keep-together.within-page = "1"> 그림 1 : 격리 된 개안 약품 준비에 필요한 도구와 장치. 사진은 위의 상세한 프로토콜에 설명 된 바와 같이 격리 된 수정란 작성을 위해 필요한 다양한 장치를 보여줍니다. 두 개의 비이커는 튜브 ( C )에 연결된 분쇄 피펫 ( D )을 청소하기 위해 물 ( A )로 채우고 다른 하나는 에탄올 ( B )로 채 웁니다. 해부 도구는 2 쌍의 벌금과 1 쌍의 거친 족집게 ( F )와 망막 scooper ( E )입니다. 망막 스커 퍼를 준비하기 위해 바늘 ( I )의 상단을 평평하게하기 위해 바이스 ( G )로 작용하는 두 개의 선반 도구 사이에서 마이크로 해부 바늘 ( H )을 누릅니다. 그런 다음 그것은 긴 pi에 연결됩니다 접착제 ( J )를 사용하여 바늘 홀더 ( E )에 장착 된 금속의 에이스. 면도날 칩 및 홀더 : 면도날 홀더 ( K )를 사용하여 면도날의 작은 삼각형 칩을 분리하여 장착하십시오. 해부 작용 영역은 2 개의 광 가이드 ( N )를 갖는 쌍안경 ( L ) 및 시원한 적색 광원 ( M )으로 구성된다. 트위저 ( F ), 망막 스커퍼 ( E ), 비커 ( A 및 B ), 적색 필터 ( Q )가있는 플래시 라이트, 섬세한 와이퍼 ( R ) 등 해부 도구가 쌍안의 양쪽에 있습니다. ES, FBS – ES, 세포 내 솔루션 주사기, 60mm 페트리 접시 ( S ), 그리고 전극 홀더 ( P )와 얼음 양동이도 테이블에 배치됩니다. 기록 전극은 수평 풀러 ( T )를 사용하여 당겨진다.e.com/files/ftp_upload/55627/55627fig1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. retinae를 분리하기 위해 망막 scooper를 구성하십시오. 두 개의 바이스 턱 사이에 마이크로 해부 바늘 (곤충 바늘, 길이 12mm, 직경 0.1mm)의 지점 (1-4mm)을 삽입하고 작은 망치로 두드려 평평하게하십시오. 마이크로 해부 식 바늘 홀더에 편평한 바늘을 장착하십시오 ( 재료 표 참조). 한 쌍의 족집게를 사용하여 ~ 2.5 mm의 곡률을 가진 후크를 형성하기 위해 바늘의 평평한 끝을 휘게하십시오. 당김 분리를위한 마찰 피펫을 만듭니다. 개방형 화염 위에 1.2 x 0.68 mm (OD x ID) 유리 모세관을 놓고 열을 줄이기 위해 그것을 닦습니다. 현미경으로 모세관 개구의 크기를 측정합니다. 생성 된 구강 분열 pipettes을 seve로 정렬n 개의 그룹 ( 예 : 0.2-0.5 mm). 별도의 적합한 용기 ( 예 : 시험관)에 보관하십시오. 하나의 작은 비이커에 이중 증류수 (DDW)를 채우고 다른 작은 비이커에 에탄올 70 %를 채우십시오. 각 비이커를 파라핀 필름 시트로 덮으십시오. DDW 비커를 덮고있는 파라핀 필름 시트에 하나의 작은 구멍을 뚫습니다 ( 그림 1A 참조 ). 에탄올 비커를 덮고있는 파라핀 필름 시트에 7 개의 작은 구멍을 뚫고 0에서 6까지의 구멍에 번호를 매 깁니다 ( 그림 1B 참조). 가장 큰 구멍을 가진 피펫은 0 번 구멍에 위치하고 가장 작은 구멍을 가진 피펫은 6 번 구멍에 위치하도록 각 파라핀 필름 구멍에 각 크기 그룹의 하나의 둥근 마찰 피펫을 놓습니다. 플라스틱 200 μL 피펫 팁을 길이 35 cm, 1.57 x 1.14 mm (OD x ID)의 폴리에틸렌 튜브에 연결하십시오. 코 넥크가장 큰 구멍 ( 예 : 0.46 – 0.5mm)을 가진 눈꺼풀 연화 피펫 중 하나에 튜빙의 다른 끝을 놓고 마찰 피펫의 뾰족한 끝 부분이 튜빙 안으로 향하지 않도록하십시오. 유리 모세관이 들어있는 1 x 0.58 mm (OD x ID) 붕규산 필라멘트에서 패치 클램프 피펫을 당겨 전체 세포 기록 피펫을 준비합니다. 참고 : 칼륨 글루코 네이트 기반 세포 내 용액 (IS1)을 사용하는 경우 피펫의 저항은 8-15 MΩ이어야합니다. 임의의 적합한 패치 피펫 풀러 (patch peller pulller )가 사용될 수있다 (예를 들어, 표 (Table of Materials ) 참조). 화염 연마는 필요하지 않습니다. 용융 파라핀 또는 고진공 실리콘 그리스를 사용하여 커버 슬립 (재료 표 참조)을 욕조 챔버 바닥에 고정하여 기록 챔버 ( 그림 2 참조)를 준비하십시오. 전극 접근 및 재관류를 허용하는 임의의 수제 또는 상업용 챔버를 사용하십시오. 거꾸로 된 현미경의 무대에 목욕을 마운트합니다. 관류 시스템 튜브, 흡입 시스템 및 그라운드 ( 예 : Ag-AgCl 와이어 / 펠렛)를 욕조 에 놓으십시오 (재료 표 및 그림 2 참조). 망막 해부 및 ommatidia 격리 단계 동안 사용하기 위해 작업 표면에 좋은 # 5 족집게 ( 그림 1 )의 두 쌍을 놓으십시오. 3. D. melanogaster 양육 Raise D. Melanogaster 는 19-24 ° C에서 표준 옥수수 음식을 담은 병에서 낮은 인구 밀도 ( 즉 , 6 온스 병에서 ~ 20 파리)로 날아 오른다. 참고 : 어두운 적응 파리에서 작업하는 것이 바람직합니다. 빛에 대한 높은 민감도를 유지하기 위해 돌연변이 파리에서 망막 변성을 방지하고 다양성을 줄입니다. 실험 전 적어도 24 시간 동안 어둠 속에서 파리를 뒤덮습니다. 참고 : 실험에 사용 된 파리는ntly eclosed (2 시간 이내), 여전히 부드럽고, 창백하고, meconium을 표시합니다. 개미는 또한 빛에 대한 감수성이 10 세에 의존적이지만 번데기로 쉽게 준비 할 수 있습니다. 4. 망막 해부 및 당뇨병 격리 : 옵션 1 참고 : 준비를 올바르게 볼 수있는 증폭을 사용하여 입체 줌 현미경에서 다음 단계를 모두 수행하십시오 ( 그림 1 참조). 뒤집힌 60mm 배양 접시에 ES-0Ca 2+ 4 방울과 TS 용액 1 방울을 놓습니다. 거친 족집게를 사용하여 날개 또는 몸체로 새 비행을 포착합니다 (<2 시간 후 eclosion). 이 시점부터 모든 절차를 20 ± 1 ° c의 어두운 조도에서 신속하게 수행하십시오. 거친 족집게로 파리를 잡는 동안 첫 번째 쌍의 섬세한 족집게를 사용하여 파리 머리를 신체에서 분리하십시오. 서브첫 es-0ca 2+ 드롭에서 헤드를 움직입니다. 두 미세 핀셋을 화살 평면을 따라 반으로 해부합니다. 단계가 끝날 때 눈이 손상되지 않도록하십시오. 헤드의 절반을 드롭으로 옮기고 나머지 절반은 세 옮깁니다. 가능한 한 눈 주위의 많은 조직을 제거하고 망막에 해를 입히지 핀셋으로 각막 가장자리를 단단히 잡고 망원경으로 망막을 퍼덕 거리십시오. 참고 :이 완료되면 각막은 않은 상태로 유지되며 망막과 분리됩니다. ddw로 튜빙에 연결된 마찰 피펫을 헹구고 네 방울에서 소량의 로 채 웁니다. 단계는 새로운 수정란 제거 사용하거나 할 때마다 수행해야합니다.m 에탄올 비커 (피펫을 채우는 용액은 망막이 잠긴 용액과 일치해야 함). 부드럽게 피펫으로 고립 된 그리기 위해 입으로 대기음. 피펫에 공기 방울이 생기지 않도록 각별히주의하십시오. 격리 ts 방울로 눈에도 4.6-4.10 단계를 물티슈를 의 물방울을 닦아 내고 페트리 접시에 모두 들어있는 방울을 남겨 둡니다. 접시 상단에 여섯 방울의 ts를 더 넣으십시오. 다른 방울 중 하나로 작은 지름의 교체하십시오. 채우기 솔루션으로 단계 4.8에서 설명한대로 린스. 신속하고 반복적으로 대기 망막 전체에서 색소 세포를 제거한 개 피부의 분리를 시작하기 솔루션에서 대기음으로내어 놓습니다. : 옴단점은 강하에서 볼 수 있으며 과정이 진행됨에 강하가 덜 반투명하게됩니다. 남은 다음 전 드롭 (격리 ommatidia를 포함)으로 채우고 목욕 방으로 드롭을 expirate. 최대 고립증을 얻으려면 4.12-4.14 반복하십시오. 개머리판이 가라 앉고 목욕실 바닥에 달라 붙을 때까지 약 분 정도 기다립니다. 재관류 시스템을 1.5 mm 칼슘 2 + 와 목욕탕 챔버에 es – 0ca 흐름을 시작합니다. 챔버가 바닥에서 상단으로 용액으로 완전히 채워지고 바닥이 용액에 잠겨 있는지 확인하십시오. 목욕을 4 ~ 5 번 씻으십시오. 5. 절개술과 당뇨병 옵션 입체 줌 현미경을 수행하십시오.( 그림 참조). 면도날 칩과 홀더를 준비하십시오. 홀더 ( )를 면도날의 삼각형 칩을 분리하여 장착하십시오. 제조 업체의 지침에 실리콘 해부 >
Representative Results
기술 된 방법은 정의 된 조건 하에서 빛에 대한 거시적 인 응답을 생성하기 위해 합계하는 자발적이고 광 유발 된 양자 범프를 생성하는 기본 단위 전류의 정확한 기록을 가능하게했다. 그것은 또한 중요한 신호 분자 ( 그림 3 과 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18에 결함이있는 야생형과 돌연변이 파리 사이의 비교를 허용했습니다. 또한, bi-ionic 조건 하에서 reversal potential을 측정하는 능력은 TRP와 TRP-like (TRPL) 채널의 기본적인 생물 물리적 특성을 밝혀냈다. 그것은 또한 Ca 2+ 를 변형시킨 TRP의 세공 영역에서 아미노산 치환 효과를 측정 할 수있게 해 주었다투자율 20 . 패치 클램프 전체 셀 기록에 의해 얻어진 빛 응답은 적어도 4 차수의 광 강도에 선형 적으로 의존합니다. 이것은 ERG 및 세포 내 기록 방법을 사용하여 해결할 수 없습니다. 따라서, 증가하는 강도의 간단한 섬광에 대한 일련의 반응 및 강도 반응 함수의 플롯은 광 세기가 증가함에 따라 플래시 응답의 엄격한 선형성을 나타내었다. 엄격한 선형성은 적어도 수백 pA까지 유지되지만, 이후에는 선형성 또는 고장을 일으키는 클램프 제어인지 여부는 논쟁의 여지가 있습니다 ( 그림 6 ). 이러한 결과는 빛에 대한 거시적 인 반응이 빛에 대한 단일 응답 ( 즉, 양자 범프)의 선형 합계임을 시사한다. 그것은 빛 자극 ind를 어둡게하는 전압 기록을 사용하여 잘 확립되어왔다.대부분의 무척추 동물에서 개별적인 전압 변동 ( 즉, 양자 범프)이 발생합니다. D. melanogaster 양자 범프는 범프 18 의 피크에서 ~ 15 TRP 채널과 ~ 2 TRPL 채널의 공동 개통으로 인해 발생합니다. 각각의 범프는 단일 광자의 흡수에 의해 생성되는 반면,보다 강렬한 빛에 대한 거시적 인 반응은 이들 기본 응답의 합계 14 , 21 이다. 범프는 자극 조건이 동일한 경우에도 대기 시간, 시간 경과 및 진폭이 크게 다릅니다. 범프 발생은 포아송 (Poisson) 통계에 의해 기술 된 확률 과정 (stochastic process)으로, 효과적으로 흡수 된 각각의 광자는 단지 하나의 범프만을 유도한다. 단일 – 광자 – 단일 범프 관계는 캐스케이드의 각 단계가 효율적인 "턴온"메커니즘뿐만 아니라 똑같이 효과적인 "턴 오프"메커니즘을 포함 할 것을 요구합니다. 기능적 이점은매우 민감한 광자 카운터는 시각적 시스템에 필요한 감도와 시간 해상도에 매우 적합한 빠른 과도 응답을 제공합니다. 능동적 인 photopigment ( 즉, metarhodopsin, M) 또는 그것의 타겟 인 G q α가 불 활성화되지 않고 빛이 꺼진 후에도 계속적으로 범프가 생성 될 때 효율적인 턴 오프 메커니즘에 대한 요구 사항이 드러난다. 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . 범프는 미세 융모에서 TRP / TRPL 채널의 협력 활동을 나타냅니다. 이와 같이, 채널 활성화의 임의의 가설은 협력 채널 활성화를 또한 설명해야한다. 최근 하디 (Hardie)와 동료들은 빛이 광 수용체의 빠른 수축을 불러 일으킨다는 것을 보여 주었는데, 이는 감광제e 채널 (TRP / TRPL)은 기계적으로 게이팅 될 수 있습니다 25 . 이 기계적 활성화는 PLC 매개 PIP 2 가수 분해에 의해 방출 된 관찰 된 양성자와 함께 TRP / TRPL 채널의 개방을 촉진하고 범프 생산의 협동 특성을 설명한다. 현재 D. melanogaster 광 수용체는 phosphoinositide 신호 전달 및 TRP 채널 을 생체 내 에서 연구 할 수있는 몇 가지 시스템 중 하나이므로 D. melanogaster 광전 변환을 만들고이 메커니즘을 연구하는 방법이 개발되어 매우 유용한 모델 시스템입니다. 그림 3 : inaC P209 와 inaD P215 돌연변이 체는 빛과 단일 양자 범프에 대한 거시적 반응의 느린 응답 종료를 나타냅니다. ( A ) 고립 된 개 모세 혈관 예비형광 루시퍼 옐로우 CH 염료 (여기 : 430 nm, 방출 : 540 nm)로 채워진 패치 피펫으로 배양 한 후 전체 세포를 녹음 하였다. 형광 염료는 하나의 광 수용체 세포 몸체를 확산 및 표지하고 광 수용체 세포 몸체는 길쭉한 축색 돌기에서 분리되지만 생존력을 유지한다는 점에 유의하십시오. 이 준비는 전체 세포 녹음 및 영상 실험을 동시에 수행하는 데 적합합니다. ( BD ) 상단 패널 : WT, inaC P209 및 inaD P215 돌연변이 플라이에서 연속 희미한 빛 (열린 막대)에 대한 전체 셀 전압 클램프 된 양자 범프 응답. 범프의 느린 종결은 WT 파리에 비해 inaC P209 및 inaD P215 돌연변이에서 관찰됩니다. 아래의 삽 입은 단일 범프의 확대 된 모양을 표시합니다. 하단 패널 : 정규화 된 전체 세포는 위의 야생형의 500ms 광 펄스 (1.5 x 10 5 광자 / 초)에 대한 거시적 인 응답을 기록했습니다. 돌연변이 파리. (EG) 상단 패널 : 야생형, arr2 3 및 ninaC P235 돌연변이 파리에서 단일 광자 반응을 유발하는 짧은 (1 ms) 희미한 빛에 대한 전체 셀 전압 클램프 된 양자 범프 응답. 단일 광자 흡수에 대한 반응으로 arr2 3 및 ninaC P235 돌연변이 파리에서 관찰 된 범프 트레인에 주목하십시오. 하단 패널 : 전체 셀 전압은 대응하는 돌연변이 체에서 500 ms 광 펄스 (1.5 x 10 4 광자 / s)에 대한 정규화 된 응답을 고정했습니다. arr2 3 에서 관찰 된 거시적 반응의 느린 종결에 주목하십시오 및 ninaC P235 돌연변이 체는 WT에 비하여 파리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. d / 55627 / 55627fig4.jpg "/> 그림 4 : 신호 유도 된 칼슘 2+ 주입 후 세포질 칼슘 2+ 역학은 칼 포틴에 의해 영향을받습니다. 야생형과 Cpn 1 % 의 광 수용체 이미지의 시계열은 빛 자극 동안 Ca 2+ 지시약의 형광을 나타냅니다. 원시 강도 영상은 잘못된 색상 코딩 (막대 = 10 μm, 화살촉은 피펫을 나타냄)을 사용하여 플롯됩니다. Weiss 외의 허가를 받아 증쇄 된 그림 . 4 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5 : WT, trp 및 trpl 돌연변이 체의 전기 생리 학적 성질. ( A ) 전체 셀 전압 클램프 리코WT, trp 302 및 trp P343 null 돌연변이 플라이의 연속적인 희미한 빛 (열린 막대)에 대한 응답으로 양자 범프의 돌출부. trp P34 3 범프의 크게 감소 된 진폭이 관찰됩니다. 삽입 : wildtype과 trp P343 null 돌연변이 플라이의 확대 된 단일 양자 범프가 표시됩니다. ( B ) 야생형의 3 초 광 펄스 및 해당 돌연변이 체에 대한 반응으로 전체 세포 전압 클램프 기록. trp P343 돌연변이 체의 일시적인 정상 상태 응답이 관찰됩니다. 삽입 : WT 및 trp P343 돌연변이 체의 확대 된 빛 반응이 표시됩니다. ( C ) 역전 전위 (E rev )를 중심으로 측정 한 3 mV의 전압 단계에서 20 ms 광 펄스에 반응하여 유도 된 상기 플라이 변형의 중첩 된 광 유도 전류 군. ( D ) wildtype의 평균 E rev 와 다양한 mutan을 플로팅하는 히스토그램ts. 오류 막대는 SEM입니다. WT의 역전 전위 (E rev )는 TRP 만 나타내는 trpl 302 의 양의 전자 레인지와 TRPL 만 나타내는 trp P343 null 돌연변이의 전자 레인지 사이에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6 : 플래시 응답은 빛의 강도가 증가함에 따라 엄밀히 선형입니다. 빛의 강도가 증가하는 간단한 섬광에 대한 현재의 일련의 반응과 짧은 빛의 섬광의 증가하는 강도에 대한 빛의 반응의 피크 진폭의 의존성에 대한 플롯. 이 관계는 플래시 응답과 증가하는 광 강도 간의 엄격한 선형성을 나타냅니다. 이 엄격한 선형성빛의 강도가 4 차수 이상에 걸쳐서 적어도 수백 pA를 유지하는 반면 선형성이든 아니면 이후에 고장 나게되는 클램프 제어인지는 논쟁의 여지가있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. pH 7.15 (NaOH로 조절) 시약 농도 (mM) NaCl 120 KCl 5 MgCl2 4 TES 10 프롤린 25 세 알라닌 5 -20 ° C에서 보관하십시오. <td colspan= "2"> 참고 :이 솔루션은 명목상 Ca 2+ 가 없지만 Ca 2+ 완충액이 첨가되지 않았으므로 약 5 – 10μM의 Ca 2+가 추가 됩니다. Extracellular solution (ES) = ES-0Ca 2+ 에 1.5 또는 1 M 재고 용액에서 CaCl 2 를 첨가하여 만든 1.5 mM CaCl 2의 ES-0Ca 2+ . 표 1 : Ca +2 없는 세포 외 용액 (ES). 화학적 설명 및 Ca +2가 없는 ES의 생산에 필요한 특정 양. 시약 양 FBS 15 mL 자당 1.5 g 1.5 mL 바이알에 150 μL 분량으로 나누어 -20 °에 보관하십시오 76, C. 연화 액 (TS) 해부 동안 사용 된 용액과 일치하도록 원액 150 mL의 1 바이알에 1,350 mL의 ES 또는 ES-0Ca 2+ 를 채 웁니다. 표 2 : 태아 소 혈청 (FBS) + 자당 스톡 용액. 태아 소 혈청 (FBS) + 자당 스톡 솔루션의 생산에 필요한 화학적 설명 및 특정 양. pH 7.15 (KOH로 조정) 시약 농도 (mM) 글루 콘산 칼륨 (Kglu) 140 MgCl2 2 TES 10 ATP 마그네슘 염 (MgATP) 4 GTP 나트륨 염 (Na2GTP) 0.4 β- 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오타이드 수화물 (NAD) 1 -20 ° C에서 보관하십시오. 표 3 : 세포 내 용액 (IS1). 화학적 설명과 IS1 생산에 필요한 특정 양은 주로 강도 응답 및 양자 범프 측정에 사용됩니다. pH 7.15 (CsOH로 조정) 시약 농도 (mM) CsCl 120 MgCl2 2 TES 10 ATP 마그네슘 염 (MgATP) 4 GTP 나트륨 염 (Na2GTP) 0.4 β- 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오타이드 수화물 (NAD) 1 테트라 에틸 – 염화 암모늄 (TAE) 15 명 -20 ° C에서 보관하십시오. 표 4 : 세포 내 용액 (IS2). 광학적 유도 전류의 역전 전위 측정에 주로 사용되는 세포 내 용액 IS2를 생성하는 데 필요한 화학적 설명 및 특정 양.
Discussion
D. melanogaster 광 수용체에 대한 전체 세포 기록의 응용은 TRP 채널 27 , 28 , 29 및 INAD 30 , 31 , 32 스캐 폴드 단백질과 같은 새로운 신호 전달 단백질의 발견 및 기능적 해명을 가능하게했다. 이 기법을 처음 도입 한 이래로 이온 반응 메커니즘에 대한 장기적인 기본 문제를 해결할 수있었습니다. 이것은 멤브레인 전압과 세포 및 세포 내 이온 조성물 19 , 28 을 정확하게 제어 할 수있는 능력이 부여 되었기 때문에 발생했습니다.
D. melanogaster 에서의 패치 클램핑 기술의 주요 장애는 격리 된 개 구균 제거제의 취약성이다정액. 상세한 연구에 따르면 광전도 기계 장치의 무결성은 ATP의 지속적인 공급, 특히 빛에 노출되는 동안 ATP의 대량 소모로 이어지는 것이 중요합니다. 불행히도 패치 피펫으로 광 수용체 막에 도달하는 데 필요한 안료 ( 즉, glia) 세포의 기계적 스트라이핑은 ATP 생산에 필요한 주요 대사 물질을 제거합니다 33 . 기록 피펫으로의 외인성 ATP의 적용은 다량의 ATP에 대한 요건을 부분적으로 충족시킨다. ATP의 공급 부족은 TRP 채널의 자발적인 활성화와 빛 활성화 된 채널에서 광 전달 메커니즘의 해리로 연결되어 세포질 Ca 2+의 증가와 빛에 대한 정상적인 반응의 폐지를 초래한다. 이러한 일련의 사건은해부 절차에 의해 광 수용체가 아니라 오히려 ATP의 세포 고갈. 이러한 일련의 사건이 발생하지 않도록하고 정상적인 빛 반응을 유지하려면 광 수용체를 강렬한 빛에 노출 시켜서는 안되며 많은 양의 ATP를 섭취해야합니다. 또한, NAD는 기록 피펫에 포함되어야하며 아마도 미토콘드리아에서 ATP 생산을 촉진해야한다. 자발적 및 양자 범프의 측정을 위해서는 희미한 조명 만 사용되기 때문에 위의 어려움은 최소화됩니다. 실제적으로 안정된 전체 세포 기록은 ~ 20 ~ 25 분 동안 유지 될 수 있지만, 반응 속도론이이 기간 동안 느려지는 경향이있다. 해리 된 각화 증의 단일 제제는 최대 2 시간 동안 생존 할 수있다.
고립 된 개조 제제의 또 다른 단점은 TRP의 접근 불가능 성으로 해석되는 미생물의 접근 불가능 성이며,TRPL 채널을 녹음 피펫에 연결하여 단일 채널 녹음을 방지합니다. 그들이 개발 한 방법을 사용하여, Bacigalupo와 동료들은 횡문 면도 37 에서 단일 채널 활동을 직접 기록하는 데 성공했다. 그러나,이 채널 활성은 조직 배양 세포에서 이종적으로 발현 된 TRPL 채널의 것과는 다르며, 고립 된 개 구균 34 에서 얻은 샷 잡음 분석에서 파생 된 TRP 채널 활성과는 다릅니다. 아마도,이 방법을 사용할 때 해부 절차는 광 수용체 세포를 크게 손상 시켰습니다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구의 실험적 부분은 미국 이스라엘 바이 사이언스 재단 (BM 및 IL), 이스라엘 과학 재단 (ISF), 독일 – 이스라엘 프로젝트 개발 (DIP) (BM으로), 그리고 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회 (BBSRC 교부금 번호 : BB / M007006 / 1 및 BB / D007585 / 1)에서 RCH
Materials
| 10 ml syringe | |||
| 5 ml syringe | |||
| 1 ml syringe with elongated tip | |||
| Petri dish | 60 mm | ||
| Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
| Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
| 2 small beakers | 50 ml or less | ||
| 2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
| Bath chamber | home made | ||
| Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
| Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
| Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
| Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
| Micro dissecting needle holder | |||
| Vise | |||
| 2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
| Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
| Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
| Osilloscope | GW | GOS-622G | |
| Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
| Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
| Suction system | |||
| Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
| Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
| Clampex | Molecular Device | 10 | software |
| pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
| Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
| Light detector | home made | phototransistor | |
| Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
| Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
| Light guide | Quartz | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
| Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
| Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
| Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
| CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
| NIS Element | Nikon | AR | software |
| Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
| Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
| Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
| Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |
Referenzen
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Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (124), e55627, doi:10.3791/55627 (2017).