से पूरे सेल वोल्ट क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधि<em> ड्रोसोफिला</em> फोटोरिसेप्टर
Summary
ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर फोटोरिसेप्टर से होल-सेल रिकॉर्डिंग, विभिन्न स्थितियों के तहत सहज अंधेरे धक्कों, क्वांटम बाम्प्स, प्रकाश के लिए मैक्रोस्कोपिक प्रतिक्रियाओं, और वर्तमान-वोल्टेज रिश्तों की माप को सक्षम करते हैं। डी। मेलानोगस्टर आनुवंशिक हेरिपूल उपकरण के संयोजन के साथ, यह विधि सर्वव्यापी इनोसिटोल-लिपिड सिग्नलिंग मार्ग और उसके लक्ष्य, टीआरपी चैनल के अध्ययन को सक्षम बनाता है।
Abstract
ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर फोटोरिसेप्टर से पूरे सेल वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग ने एकल-अणु स्तर पर inositol-lipid सिग्नलिंग और क्षणिक रिसेप्टर पोटेंशियल (टीआरपी) चैनलों का अध्ययन करने के लिए डी। मेलेनोगास्टर आणविक आनुवंशिकी के उपयोग को सक्षम करने के लिए, अकशेरुकीय दृश्य ट्रांसडक्शन के क्षेत्र में क्रांति लाई है। कुछ उपयोगी प्रयोगशालाओं ने इस शक्तिशाली तकनीक को हासिल किया है, जो अत्यधिक नियंत्रित परिस्थितियों में प्रकाश के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है। इस तकनीक को इंट्रासेल्युलर और बाह्य मीडिया पर नियंत्रण की अनुमति है; झिल्ली वोल्टेज; और फार्माकोलॉजिकल यौगिकों का तेजी से प्रयोग, जैसे विभिन्न प्रकार के ईओणिक या पीएच संकेतक, इंट्रा- और बाह्य मीडिया के लिए। एक असाधारण उच्च संकेत-टू-शोर अनुपात के साथ, यह विधि अंधेरे सहज और हल्के प्रेरित एकात्मक धाराओं ( यानी सहज और क्वांटम बाउंस) और मैक्रोस्कोपिक हल्की प्रेरित धाराओं (एलआईसी) के पाप से सक्षम बनाता हैगैले डी। मेलेनोगास्टर फोटोरिसेप्टर इस प्रोटोकॉल का विस्तार, महान विवरण में, इस तकनीक को करने के लिए आवश्यक सभी प्रमुख कदम हैं, जिसमें इलेक्ट्रोफिजिकल और ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग दोनों शामिल हैं। बाथ चेंबर में बरकरार और व्यवहार्य पूर्व विवो पृथक ओम्पटिडिया की प्राप्ति के लिए मक्खी रेटिना विच्छेदन प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। पूरे सेल और प्रतिदीप्ति इमेजिंग मापन करने के लिए आवश्यक उपकरण भी विस्तृत हैं। अंत में, विस्तारित प्रयोगों के दौरान इस नाजुक तैयारी का उपयोग करने में नुकसान समझाया गया है।
Introduction
फलों के उड़ने के व्यापक आनुवंशिक अध्ययन, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर ( डी। मेलेनोगस्टर) , 100 से ज्यादा साल पहले की शुरुआत की, ने डी। मेलेनोगास्टर फ्लाई को जटिल जैविक प्रक्रियाओं के आनुवंशिक विच्छेदन के लिए एक अत्यंत उपयोगी प्रायोगिक मॉडल के रूप में स्थापित किया है। नीचे वर्णित पद्धति डी। मेलेनोगास्टर आणविक जेनेटिक्स की संचित शक्ति को पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के उच्च संकेत-टू-शोर अनुपात के साथ जोड़ती है। यह संयोजन डी। मेलेनोगास्टर फोटोट्रैंसडक्शन के अध्ययन के लिए इनोसिटोल -लिपिड सिग्नलिंग और टीआरपी चैनल विनियमन और सक्रियण के एक मॉडल के रूप में, देशी वातावरण में और एकल अणुओं के उच्चतम संकल्प में, दोनों के लिए अनुमति देता है।
डी। मेलेनोगास्टर फोटोरिसेप्टर के लिए पूरे सेल रिकॉर्डिंग विधि के आवेदन ने अकशेरुबेट फोटोट्रैंसडक्शन के अध्ययन में क्रांति ला दी है। यह विधि हार्डी 1 और इंडेप द्वारा विकसित की गई थीअंततः रंगनाथन और सहयोगियों द्वारा 2 ~ 26 साल पहले और डी। मेलेनोगास्टर के व्यापक आनुवंशिक हेरिपूल टूल का फायदा उठाने के लिए डिजाइन किया गया था और उन्हें फोटोट्रैंसडक्शन और इनॉसिटोल-लिपिड सिग्नलिंग के तंत्र को उजागर करने के लिए उपयोग किया गया था। सबसे पहले, इस तकनीक को प्रकाश संवेदनशीलता में तेजी से कमी और विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान ओम्पटिडिया की कम उपज से सामना करना पड़ा, जिससे विस्तृत मात्रात्मक अध्ययनों को रोका गया। बाद में, पैट विंदुक में एटीपी और एनएडी के अलावा नाटकीय रूप से लंबे समय तक मात्रात्मक रिकॉर्डिंग की तैयारी की उपयुक्तता बढ़ गई है। इसके बाद, आणविक स्तर पर संकेत-पारगमन तंत्र के व्यापक लक्षण वर्णन का एहसास हो गया।
वर्तमान में, डी। मेलेनोगास्टर फोटोट्रैंसडक्शन, कुछ प्रणालियों में से एक है जिसमें फ़ॉस्फोइनोसिटि सिग्नलिंग और टीआरपी चैनल एकल-अणु संकल्प पर पूर्व विवो का अध्ययन किया जा सकता है। यह डी। मेलानोगास्टर फोटोट्रैंसडक्शन बनाता है और मुझेथोडोलॉजी इस तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उच्च संवेदनशील मॉडल प्रणाली का विकास किया। इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि डी। मेलेनोगास्टर रेटिना का टुकड़ा कैसे निकालना है और आसपास के रंगद्रव्य (ग्लिया) कोशिकाओं से अलग-थलग ओम्पटिडिया को यंत्रवत् रूप से पोंछते हैं। यह फोटोकॉसेप्टर सेल बॉडी पर गिगा-सील और पूरे सेल पैच क्लैंप के गठन को सक्षम करता है। सौभाग्य से, सबसे सिग्नल प्रोटीन रबदोमरे तक सीमित हैं और फैलाना नहीं है। इसके अलावा, सिग्नलिंग कम्पार्टमेंट और सेल बॉडी 3 , 4 और माइक्रो + 5 सीए में Na + / Ca 2+ एक्स्चेंजर (कैलक्स) के उच्च अभिव्यक्ति स्तर के बीच स्थित कैल्फोटीन नामक एक स्थिर सीए 2 + बफर है। साथ में, रबदोमरे, कैल्फोोटिन बफर और कैल्क्स की उच्च अभिव्यक्ति के लिए प्रोटीन कारावास अपेक्षाकृत लंबे समय तक ( अर्थात ~ 20 मिनट तक) पूरे सेल रिकॉर्डिंग, आवश्यक घटकों के नुकसान के बिना अनुमति देता हैफोटोट्रैंसडक्शन प्रक्रिया की और प्रकाश को उच्च संवेदनशीलता बनाए रखते हुए निम्न प्रोटोकॉल का वर्णन है कि पृथक ओम्पटिडिया कैसे प्राप्त करें और पूरे सेल रिकॉर्डिंग को प्रदर्शित करें जो फोटोट्रैंसडक्शन कैस्केड के मूल गुणों को संरक्षित करते हैं। अलग-अलग तिलचट्टा ( पेरिप्लानेटा अमेरीकाना ) 6 और क्रिकेट ( ग्रीलस बिमानुलेटस ) पर पूरे सेल पैच क्लैंप प्रयोग 7 ओममटिडिया इसी तरह डी। मेलेनोगास्टर के लिए वर्णित किए गए थे। इसके अलावा, फ़ाइल क्लैम, ( लीमा स्कैरा ) और स्कैलप ( पक्टेन ईराडियन ) के अलग-अलग फोटोरिसेप्टर पर पैच क्लैंप प्रयोगों को डी। मेलेनोगास्टर पर आयोजित एक अलग तरीके से किया गया , जिससे पूरे सेल 8 और सिंगल-चैनल माप की अनुमति मिलती है 9 यहां, इस तकनीक का उपयोग करके डी। मेलेनोगास्टर में प्राप्त प्रमुख उपलब्धियों का वर्णन किया गया है। चर्चा iइस तकनीक के कुछ नुकसान और सीमाओं के वर्णन को शामिल नहीं करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
डी। मेलेनोगास्टर फोटोरएप्टरों के लिए पूरे सेल रिकॉर्ड्स के आवेदन की खोज और उपन्यास सिग्नल प्रोटीन, जैसे टीआरपी चैनल 27 , 28 , 29 और आईएनएडी 30 , 31 , 32 स्कैफोल्ड प्रोटीन की कार्यात्मक व्याख्यान के लिए अनुमति दी गई है। इस तकनीक का प्रारंभिक परिचय होने के बाद से, यह ईओण तंत्र और प्रकाश प्रतिक्रिया के वोल्टेज निर्भरता के संबंध में दीर्घकालिक बुनियादी प्रश्नों के समाधान को सक्षम करता है। यह झिल्ली वोल्टेज और बाह्य और इंट्रासेल्युलर आयनिक संरचना 19 , 28 को सटीक रूप से नियंत्रित करने की प्रदत्त क्षमता की वजह से हुई।
डी। मेलेनोगास्टर में पैच क्लैम्पिंग तकनीक की एक बड़ी बाधा पृथक ओम्पटिडिया प्रीपा की नाजुकता रही हैराशन। विस्तृत अध्ययनों से पता चला है कि फोटोट्रैंसडक्शन मशीनरी की अखंडता एटीपी की लगातार आपूर्ति पर निर्भर करती है, विशेष रूप से प्रकाश जोखिम के दौरान, जो एटीपी की बड़ी खपत का कारण बनती है दुर्भाग्य से, रंजक ( यानी ग्लिया) कोशिकाओं के मैकेनिकल स्ट्रिपिंग, जो पैच विंदुक के साथ फोटोरिसेप्टर झिल्ली तक पहुंचने की आवश्यकता होती है, एटीपी उत्पादन 33 के लिए आवश्यक चयापचयों के मुख्य स्रोत को समाप्त करता है। रिकॉर्डिंग विंदुक में बहिर्जात एटीपी के आवेदन केवल आंशिक रूप से एटीपी की बड़ी मात्रा के लिए आवश्यकता को पूरा करता है। एटीपी की एक छोटी आपूर्ति टीआरपी चैनलों के सहज सक्रियण और प्रकाश-सक्रिय चैनलों से फोटोट्रैंसडक्शन मशीनरी के पृथक्करण की ओर ले जाती है, जिससे सेल्यूलर सीए 2+ में बड़ी वृद्धि हो सकती है और प्रकाश 34 , 35 के सामान्य प्रतिक्रिया को समाप्त नहीं किया जा सकता है। घटनाओं का यह क्रम क्षतिग्रस्त नहीं हैविच्छेदन प्रक्रिया द्वारा फोटोरिसेप्टर, लेकिन एटीपी की सेलुलर कमी के बजाय। होने वाली घटनाओं को रोकने के लिए और सामान्य हल्के प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने के लिए, फोटोरिसेप्टर तीव्र रोशनी से अवगत नहीं होना चाहिए, जो बड़ी मात्रा में एटीपी का उपयोग करता है। इसके अलावा, एनएडी को रिकॉर्डिंग विंदुक में शामिल किया जाना चाहिए, संभवतः मिटोचोनड्रिया 18 , 36 में एटीपी उत्पादन की सुविधा के लिए। सहज और क्वांटम बाम्प्स की मापन के लिए, ऊपर की कठिनाई कम है क्योंकि केवल मंद रोशनी का उपयोग किया जाता है। व्यवहार में, एक स्थिर पूरे सेल रिकॉर्डिंग को ~ 20-25 मिनट तक बनाए रखा जा सकता है, हालांकि इस अवधि में प्रतिक्रिया धीमी गति के लिए कैनेटीक्स की प्रवृत्ति होती है। अलग-अलग ओम्पटिडिया की एक भी तैयारी 2 घंटे तक के लिए व्यवहार्य बना सकती है।
पृथक ओम्पटिडिया तैयारी की एक अतिरिक्त कमी microvilli की अनुपलब्धता है, जो कि टीआरपी की अनुपलब्धता औररिकॉर्डिंग विंदुक के लिए ट्रिपल चैनल, एकल चैनल रिकॉर्डिंग को रोकने। उन्होंने विकसित एक विधि का उपयोग करते हुए, बासिगलुपो और उनके सहकर्मियों ने सीधे रुबोडोररे 37 से एकल-चैनल गतिविधि को रिकॉर्ड करने में सफलता प्राप्त की। हालांकि, यह चैनल गतिविधि टीआरपीयूएल चैनलों से भिन्न है जो ऊतक संवर्धन कोशिकाओं 38 में व्यक्त की गई है और टीआरपी चैनल गतिविधि से पृथक ओम्माटीडिया 34 से प्राप्त शोर शोर विश्लेषण से प्राप्त हुई है। संभवतः, इस पद्धति का उपयोग करते समय विच्छेदन प्रक्रिया ने फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं को काफी नुकसान पहुंचाया।
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध का प्रायोगिक हिस्सा यूएस-इजरायल द्विपक्षीय राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (बीएम और आईएल), इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ), जर्मन-इजरायल प्रोजेट्कोएपोरेशन (डीआईपी) (बीआईएम), और जैव प्रौद्योगिकी से अनुदान द्वारा समर्थित था और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी अनुदान संख्या: बीबी / एम 007006/1 और बीबी / डी 0757585/1) आरसीएच से
Materials
| 10 ml syringe | |||
| 5 ml syringe | |||
| 1 ml syringe with elongated tip | |||
| Petri dish | 60 mm | ||
| Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
| Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
| 2 small beakers | 50 ml or less | ||
| 2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
| Bath chamber | home made | ||
| Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
| Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
| Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
| Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
| Micro dissecting needle holder | |||
| Vise | |||
| 2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
| Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
| Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
| Osilloscope | GW | GOS-622G | |
| Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
| Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
| Suction system | |||
| Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
| Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
| Clampex | Molecular Device | 10 | software |
| pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
| Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
| Light detector | home made | phototransistor | |
| Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
| Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
| Light guide | Quartz | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
| Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
| Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
| Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
| CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
| NIS Element | Nikon | AR | software |
| Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
| Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
| Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
| Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |
Referenzen
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