כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.
כל מתח מתח clamp הקלטות מ תסיסנית melanogaster photoreceptors חוללו מהפכה בתחום transduction חזותית חוליות, המאפשר את השימוש של ד melanogaster מולקולרית גנטיקה ללמוד inositol- ליפידים איתות ו transient קולטן פוטנציאליים (TRP) ערוצים ברמת מולקולה אחת. קומץ מעבדות שולט בטכניקה חזקה זו, המאפשרת ניתוח של תגובות פיזיולוגיות לאור בתנאי מבוקר מאוד. טכניקה זו מאפשרת שליטה על התקשורת תאיים תאיים; מתח הקרום; ואת היישום המהיר של תרכובות פרמקולוגיות, כגון מגוון של אינדיקטורים יוניים או pH, על התקשורת תוך חוץ תאיים. עם יחס אות לרעש גבוה במיוחד, שיטה זו מאפשרת למדוד זרמים חד-ספריים כהים וספונטאניים ( כלומר, ספונטניות וקוונטיות) וזרמים בהזרקה מאקרוסקופית (LIC)Gle ד מלנוגאסטר photoreceptors. פרוטוקול זה מתאר, בפירוט רב, את כל הצעדים העיקריים הדרושים לביצוע טכניקה זו, הכוללת גם אלקטרו הקלטות אלקטרו אופטי. הליך לטיה רטייה זבוב להשגת vivo לשעבר שלם ושל קיימא ommatidia מבודדים בחדר אמבטיה מתואר. הציוד הדרוש כדי לבצע את כל התא פלואורסצנטי הדמיה מדידות מפורטים גם. לבסוף, את מלכודות באמצעות הכנה עדינה זו במהלך ניסויים מורחבים מוסברים.
מחקרים גנטיים נרחבים של זבוב הפירות, תסיסנית מלנוגאסטר ( ד מלנוגאסטאר) , שיזמה לפני יותר מ -100 שנה, הקימו את זבוב המלנוגאסטר ד 'כמודל ניסיוני שימושי ביותר עבור הניתוח הגנטי של תהליכים ביולוגיים מורכבים. המתודולוגיה המתוארת להלן משלבת את הכוח המצטבר של גנטיקה מולנוגאסטארית מולקולרית עם היחס בין אות לרעש גבוה של קליפ שלם של קליפים. שילוב זה מאפשר את המחקר של dot melanogaster phototransduction כמודל של inositol- ליפידים איתות ו TRP ערוץ הרגולציה והפעלה, הן בסביבה יליד ברזולוציה הגבוהה ביותר של מולקולות בודדות.
יישום של שיטת הקלטה של כל התא כדי dor melanogaster photoreceptors חוללה מהפכה במחקר של phototransduction חוליות. שיטה זו פותחה על ידי הארדי 1 ו indepבסופו של דבר על ידי Ranganathan ועמיתיו 2 ~ 26 שנים, והוא נועד לנצל את כלי מניפולציה גנטית נרחב של ד melanogaster ולהשתמש בהם כדי לחשוף מנגנונים של phototransduction ו inositol- ליפידים איתות. בתחילה, טכניקה זו סבלה מהורדה מהירה ברגישות לאור ותשואה נמוכה של אומטידיה במהלך תהליך הניתוח, אשר מנע מחקרים כמותיים מפורטים. מאוחר יותר, תוספת של ATP ו NAD כדי פיפטה תיקון להגדיל באופן דרמטי את ההתאמה של ההכנות הקלטות כמותיות ממושכות. לאחר מכן, אפיון נרחב של מנגנון התמרת האות ברמה המולקולרית מומש.
נכון לעכשיו, dot melanogaster phototransduction היא אחת המערכות כמה שבו איתות phosphoinositide ו TRP ערוצים ניתן ללמוד vivo לשעבר ברזולוציה מולקולה אחת. זה עושה ד melanogaster phototransduction ואת ליתיאודולוגיה שפותחה כדי ללמוד מנגנון זה מודל רגיש מאוד. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח את הרשתית מלנוגאסטר ד ו מכנית רצועת ommatidia מבודדים מן הפיגמנט (תאים) גליל. זה מאפשר את היווצרות של ג 'יגה חותם ואת מהדק תיקון כל תא על גופי התא photoreceptor. למרבה המזל, רוב חלבונים איתות מוגבל ל rhabdomere ולא לפזר. בנוסף, יש חיץ Ca 2 + נייח קרא calphotin, הממוקם בין תא איתות לגוף התא 3 , 4 , ואת רמת ביטוי גבוהה של Na + / Ca 2 + מחליף (CalX) ב microvilli 5 . יחד, את החלבון חלבון rhabdomere, המאגר calphotin, ואת הביטוי הגבוה של CalX לאפשר יחסית ממושכת ( כלומר עד 20 דקות) כל התא הקלטות, ללא אובדן של רכיבים חיונייםשל תהליך phototransduction תוך שמירה על רגישות גבוהה לאור. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להשיג ommatidia מבודד ולבצע הקלטות תא שלם שנראה לשמור על המאפיינים הילידים של מפל phototransduction. כל תא תיקון ניסויים מהדק על מקק מנותק ( Periplaneta אמריקה ) 6 ו קריקט ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia בוצעו באופן דומה לזה המתואר עבור ד melanogaster . בנוסף, תיקון ניסויים מהדק על photoreceptors ניתק של צדפות הקובץ, ( סקלה לימה ) ו סקאלופ ( פקטן irradians ) בוצעו בצורה שונה במקצת מזו שנערכה על ד melanogaster , המאפשר מדידות 8 ו-כל ערוץ יחיד 9 . הנה, את ההישגים העיקריים שהושגו ד melanogaster באמצעות טכניקה זו מתוארים. הדיון אכולל את התיאור של כמה מלכודות ומגבלות של טכניקה זו.
היישום של כל תא הקלטות ד מלנוגאסטור photoreceptors מותר גילוי ופונקציונציה תפקודית של חלבונים איתות חדשניים, כגון ערוצי TRP 27 , 28 , 29 ו INAD 30 , 31 , 32 פיגום חלבון. מאז הכניסה הראשונית של טכניקה זו, היא אפשרה את הפתרון של שאלות בסיסיות לטווח ארוך לגבי המנגנון היוני תלות מתח התגובה האור. זה קרה בגלל היכולת להעניק יכולת במדויק את המתח קרום תאיים תאיים הרכב תאיים 19 , 28 .
המכשול העיקרי של הטכניקה מהדק תיקון ב מלנוגאסטר כבר את השבריריות של מבודד ommatidia prepaמָנָה. מחקרים מפורטים גילו כי שלמות של מכונות phototransduction ביקורתית תלויה באספקה מתמשכת של ATP, במיוחד במהלך החשיפה לאור, אשר מוביל לצריכה גדולה של ה- ATP. למרבה הצער, פסים מכניים של פיגמנט ( כלומר גליה) תאים, אשר נדרש להגיע קרום photoreceptor עם פיפטה תיקון, מבטלת את המקור העיקרי של מטבוליטים הדרושים לייצור ATP 33 . יישום של ATP אקסוגני לתוך פיפטה ההקלטה רק חלקית ממלא את הדרישה עבור כמויות גדולות של ATP. אספקת קצר של ATP מוביל הפעלה ספונטנית של ערוצי TRP כדי ניתוק של מכונות phototransduction מן האור מופעל ערוצים, גרימת עלייה גדולה של Ca 2 + הסלולר וביטול התגובה הרגילה לאור 34 , 35 . רצף אירועים זה אינו נובע מנזקPhotoreceptors על ידי הליך לנתיחה, אלא כדי דלדול הסלולר של ה- ATP. כדי למנוע רצף אירועים זה להתרחש ולשמור על תגובות אור נורמלי, photoreceptors לא צריך להיות חשוף אורות אינטנסיביים, אשר צורכים כמויות גדולות של ה- ATP. כמו כן, NAD חייב להיכלל פיפטה ההקלטה, ככל הנראה כדי להקל על הייצור ATP במיטוכונדריה 18 , 36 . עבור מדידות של ספונטני ומכשולים קוונטיים, הקושי הנ"ל הוא מינימלי כי רק אורות עמומים משמשים. בפועל, הקלטה כל תא יציב יכול להישמר ~ 20-25 דקות, אם כי יש נטייה קינטיקה התגובה להאט לאורך תקופה זו. הכנה אחת של ommatidia ניתק עשוי להישאר קיימא עד 2 שעות.
חסרון נוסף של הכנת אומטידיה מבודדת הוא הנגישות של microvilli, אשר מתרגמת את הנגישות של TRP וTRPL ערוצים הקלטה פיפטה, מניעת הקלטות ערוץ יחיד. באמצעות שיטה שפותחה, הצליחו Bacigalupo ועמיתיו להקליט באופן ישיר פעילות ערוץ יחיד מ 37 rhabdomere. עם זאת, פעילות ערוץ זה שונה מזה של ערוצים TRPL הביע heterologously בתרבית רקמות תאים 38 ו מפעילות ערוץ TRP נגזר ניתוח רעש ירו המתקבל ommatidia מבודד 34 . יש להניח, הליך לנתיחה פגום מאוד תאים photoreceptor בעת שימוש בשיטה זו.
The authors have nothing to disclose.
החלק הניסויי של מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע של ארה"ב-ישראל (ל- BM ו- IL), לקרן המדע הישראלי (ISF), ל- Deutsch-Israelische Projektkooperation (ל- BM) ולביוטכנולוגיה ואת המועצה למדעי הביולוגיה מחקר (BBSRC גרנט מספרים: BB / M007006 / 1 ו BB / D007585 / 1) כדי RCH
10 ml syringe | |||
5 ml syringe | |||
1 ml syringe with elongated tip | |||
Petri dish | 60 mm | ||
Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
2 small beakers | 50 ml or less | ||
2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
Bath chamber | home made | ||
Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
Micro dissecting needle holder | |||
Vise | |||
2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
Osilloscope | GW | GOS-622G | |
Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
Suction system | |||
Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
Clampex | Molecular Device | 10 | software |
pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
Light detector | home made | phototransistor | |
Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
Light guide | Quartz | ||
Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
NIS Element | Nikon | AR | software |
Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |