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Neurowissenschaften

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em> Drosophila</em> Fotorezeptoren

Published: June 13, 2017
doi:
10.3791/55627
, , , ,
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC),Hebrew University, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience,University of Cambridge

Summary

Ganzzellige Aufnahmen von Drosophila Melanogaster Photorezeptoren ermöglichen die Messung von spontanen Dunkelstößen, Quantenstößen, makroskopischen Reaktionen auf Licht und Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen Bedingungen. In Kombination mit D. melanogaster genetischen Manipulationswerkzeugen ermöglicht diese Methode die Untersuchung des ubiquitären Inositol-Lipid-Signalwegs und seines Ziels, des TRP-Kanals.

Abstract

Ganzzellige Spannungsklemmenaufnahmen von Drosophila melanogaster Photorezeptoren haben das Feld der wirbellosen visuellen Transduktion revolutioniert, was die Verwendung von D. melanogaster Molekulargenetik ermöglicht, um Inositol-Lipid-Signalisierung und Transient Receptor Potential (TRP) -Kanäle auf Einzelmolekül-Ebene zu untersuchen. Eine Handvoll Labore haben diese mächtige Technik beherrscht, die es ermöglicht, die physiologischen Reaktionen unter stark kontrollierten Bedingungen zu beleuchten. Diese Technik ermöglicht die Kontrolle über die intrazellulären und extrazellulären Medien; Die Membranspannung; Und die schnelle Anwendung von pharmakologischen Verbindungen, wie einer Vielzahl von Ionen- oder pH-Indikatoren, auf die intra- und extrazellulären Medien. Mit einem außergewöhnlich hohen Signal-Rausch-Verhältnis ermöglicht dieses Verfahren die Messung von dunklen spontanen und lichtinduzierten Einheitsströmen ( zB Spontan- und Quantenstößen) und makroskopischen Lichtinduzierten Strömen (LIC) aus der SündeGle D. melanogaster photorezeptoren Dieses Protokoll skizziert im Detail alle wichtigen Schritte, die notwendig sind, um diese Technik durchzuführen, die sowohl elektrophysiologische als auch optische Aufnahmen beinhaltet. Das Fliegen-Retina-Dissektionsverfahren für die Erreichung von intakten und lebensfähigen ex vivo- isolierten Omatidien in der Badkammer wird beschrieben. Die Ausrüstung, die für die Durchführung von Ganzzell- und Fluoreszenz-Bildgebungsmessungen erforderlich ist, ist ebenfalls detailliert. Schließlich werden die Fallstricke bei der Verwendung dieser zarten Vorbereitung bei längeren Experimenten erklärt.

Introduction

Umfangreiche genetische Untersuchungen der Fruchtfliege , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , die vor mehr als 100 Jahren initiiert wurde, haben die D. melanogaster- Fliege als äußerst nützliches experimentelles Modell für die genetische Dissektion komplexer biologischer Prozesse etabliert. Die unten beschriebene Methodik kombiniert die akkumulierte Kraft von D. melanogaster Molekulargenetik mit dem hohen Signal-Rausch-Verhältnis von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen. Diese Kombination ermöglicht die Untersuchung von D. melanogaster Phototransduktion als Modell der Inositol-Lipid-Signalisierung und TRP-Kanalregulation und -aktivierung sowohl in der nativen Umgebung als auch in der höchsten Auflösung einzelner Moleküle.

Die Anwendung der Ganzzell-Aufzeichnungsmethode auf D. melanogaster Photorezeptoren hat das Studium der Wirbellosen-Phototransduktion revolutioniert. Diese Methode wurde von Hardie 1 und indep entwickeltEndlich von Ranganathan und Kollegen vor 2 ~ 26 Jahren und wurde entworfen, um die umfangreichen genetischen Manipulationswerkzeuge von D. melanogaster auszunutzen und sie zu verwenden, um Mechanismen der Phototransduktion und Inositol-Lipid-Signalisierung aufzudecken. Zunächst litt diese Technik unter einer raschen Verringerung der Lichtempfindlichkeit und einer geringen Ausbeute an Ommatidien während des Sektionsprozesses, die detaillierte quantitative Studien verhinderten. Später erhöhte die Zugabe von ATP und NAD zur Patchpipette die Eignung der Präparation für längere quantitative Aufnahmen drastisch. Danach wurde eine umfangreiche Charakterisierung des Signaltransduktionsmechanismus auf molekularer Ebene realisiert.

Derzeit ist die D. melanogaster- Phototransduktion eines der wenigen Systeme, in denen Phosphoinositid-Signalisierungs- und TRP-Kanäle ex-vivo bei Einzelmolekül-Auflösung untersucht werden können. Das macht D. melanogaster fototransduktion und das ichThodologie entwickelt, um diesen Mechanismus ein hochempfindliches Modellsystem zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie man die D. melanogaster retina seziert und die isolierten Ommatidien mechanisch von den umgebenden Pigment (Glia) Zellen abstreift. Dies ermöglicht die Bildung einer Giga-Dichtung und einer Ganzzell-Patch-Clamp auf den Photorezeptor-Zellkörpern. Glücklicherweise sind die meisten Signalisierungsproteine ​​auf das Rhabdomere beschränkt und diffundieren nicht. Darüber hinaus gibt es einen immobilen Ca 2+ -Puffer namens Calphotin, der sich zwischen dem Signalisierungskompartiment und dem Zellkörper 3 , 4 befindet , und einem hohen Expressionsniveau des Na + / Ca 2+ -Tauscher (CalX) im Mikrovilli 5 . Gemeinsam erlauben die Protein-Confinement zum Rhabdomere, der Calphotin-Puffer und die hohe Expression des CalX relativ lange ( dh bis zu ~ 20 min) Ganzzell-Aufnahmen ohne den Verlust wesentlicher KomponentenDes Phototransduktionsverfahrens und unter Beibehaltung einer hohen Lichtempfindlichkeit. Das folgende Protokoll beschreibt, wie man isolierte Omatidien erhält und ganze Zellaufnahmen durchführt, die die nativen Eigenschaften der Phototransduktionskaskade bewahren. Vollständige Patch-Clamp-Experimente auf dissoziierten Kakerlaken ( Periplaneta americana ) 6 und Cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 Ommatidien wurden ähnlich wie bei D. melanogaster durchgeführt . Darüber hinaus wurden Patch-Clamp-Experimente an dissoziierten Photorezeptoren der File-Clam, ( Lima scabra ) und Jakobsmuschel ( Pecten-Irradianer ) in einer etwas anderen Weise als die von D. melanogaster durchgeführt , wobei sowohl die Ganzzell- 8- als auch die Einkanal-Messungen durchgeführt wurden 9 Hier werden die wichtigsten Errungenschaften, die in D. melanogaster mit dieser Technik erhalten wurden, beschrieben. Die Diskussion iSchließt die Beschreibung einiger Fallstricke und Einschränkungen dieser Technik ein.

Protocol

1. Reagenzvorbereitung HINWEIS: Vorbereiten Sie alle Lösungen gemäß den Anweisungen in den Tabellen 1-4 . Füllen Sie eine 10-ml-Spritze mit extrazellulärer Lösung (ES oder ES-0Ca 2+ , wie erforderlich, siehe Tabelle 1 ) und auf Eis aufbewahren. Bereiten Sie eine Durchstechflasche der Triturierungslösung vor (TS, siehe Tabelle 2 , dh ES oder ES-0Ca 2+ + FBS und Saccharose) und halten Sie diese auf Eis. Bereiten Sie genügend ES für das Experiment vor und bewahren Sie das auf Eis, bis es nötig ist. HINWEIS: Eine kontinuierliche Badperfusion ist nicht erforderlich, daher muss das ES-Volumen nicht mehr als ein paar Dutzend ml betragen. Mit einem 22 μm PVDF-Filter die intrazelluläre Lösung (siehe Tabelle 3 oder Tabelle 4 ) in eine 1-ml-Spritze mit einer Elektrode einfüllen, die eine längliche Spitze füllt. Halten Sie das auf Eis. 2. Allgemeine Einrichtung von Dissektionswerkzeugen <p class="Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Abbildung 1: Werkzeuge und Vorrichtungen, die für die Herstellung der isolierten Ommatidien Vorbereitung benötigt werden. Die Bilder zeigen die verschiedenen Vorrichtungen, die für die Herstellung der isolierten Ommatidienpräparation erforderlich sind, wie im ausführlichen Protokoll oben beschrieben. Zwei Becher, eine mit Wasser ( A ) und die andere mit Ethanol ( B ) gefüllt, um die Triturationspipetten ( D ) zu reinigen, die mit dem Schlauch ( C ) verbunden sind. Die Sektionswerkzeuge sind: 2 Paar fein und 1 Paar grobe Pinzette ( F ) und eine Netzhautschaufel ( E ). Zur Vorbereitung des Retina-Scooperes wird eine Mikrosissektionsnadel ( H ) zwischen zwei Drehwerkzeugen gedrückt, die als Schraubstock ( G ) wirken, um die Oberseite der Nadel ( I ) zu glätten. Dann ist es mit einem langgestreckten pi verbunden Ece Metall mit Kleber ( J ) und auf einem Nadelhalter ( E ) montiert. Rasierklingen-Chip und -Halter: Abbruch und Montage eines kleinen dreieckigen Chips eines Rasierklingees mit einem Rasierklingenhalter ( K ). Der Sektionsarbeitsbereich besteht aus einem binokularen ( L ) und einer kühlen roten Lichtquelle (( M), ) mit zwei Lichtleitern ( N ). In beiden Seiten des Binokulars befinden sich die Sezierwerkzeuge, einschließlich der Pinzette ( F ), der Retina Scooper ( E ), der Becher ( A und B ), einer Taschenlampe mit einem roten Filter ( Q ) und zarten Wischern ( R ). Ein Eiskübel mit dem ES, dem FBS-ES, den intrazellulären Lösungsspritzen, der 60 mm Petrischale ( S ) und dem Elektrodenhalter ( P ) werden ebenfalls auf den Tisch gelegt. Die Aufzeichnungselektroden werden mit einem horizontalen Abzieher ( T ) gezogen.E.com/files/ftp_upload/55627/55627fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Konstruieren Sie eine Retina Scooper, um die Retinae zu isolieren. Setzen Sie den Punkt (1-4 mm) einer Mikrodissektionsnadel (entomologische Nadel, 12 mm Länge, 0,1 mm Durchmesser) zwischen den beiden Schraubbögen ein und glätten Sie ihn mit einem kleinen Hammer. Montieren Sie die abgeflachte Nadel auf einem mikrosezierenden Nadelhalter (siehe Tabelle der Materialien ). Mit einem Paar Pinzetten, Kurve das abgeflachte Ende der Nadel zu einem Haken mit einer Krümmung von ~ 2,5 mm zu bilden. Erstellen Sie Triturationspipetten für die Ommatidien-Trennung. Legen Sie eine Glaskapillare von 1,2 x 0,68 mm (OD x ID) über eine offene Flamme und feuern Sie sie ab, um ihre Öffnung zu reduzieren. Messen Sie die Größe der Kapillarenöffnung unter einem Mikroskop. Sortieren Sie die erzeugten ommatidial trituration pipettes in seveN-Gruppen je nach Größe ihrer Öffnungen ( dh 0,2-0,5 mm). Lagern Sie sie in separaten geeigneten Behältern ( zB Reagenzgläser). Füllen Sie einen kleinen Becher mit doppelt destilliertem Wasser (DDW) und einem weiteren kleinen Becher mit Ethanol 70%. Bedecken Sie jeden Becher mit einer Paraffinfolie. Stanzen Sie ein kleines Loch in das Paraffin-Folienblatt, das den DDW-Becher bedeckt (siehe Abbildung 1A ). Stanzen Sie sieben kleine Löcher in die Paraffinfolie, die den Ethanolbecher bedeckt, und nummerieren Sie die Löcher von 0 bis 6 (siehe Abbildung 1B ). Legen Sie eine ommatidiale Triturationspipette von jeder Größengruppe in jedes Paraffinfilmloch, so dass sich die Pipette mit der größten Öffnung im 0. Loch befindet und die Pipette mit der kleinsten Öffnung im 6. Loch liegt. Verbinden Sie eine Plastik 200 μL Pipettenspitze mit einem 35 cm langen, 1,57 x 1,14 mm (OD x ID) Stück Polyethylenschlauch. VerbindenT das andere Ende des Schlauches zu einer der ommatidialen Verreibungspipetten mit der größten Öffnung ( dh 0,46 – 0,5 mm), um sicherzustellen, dass das spitze Ende der Triturationspipette nicht in den Schlauch gerichtet ist. Vorbereitung von Ganzzell-Aufzeichnungspipetten durch Ziehen von Patch-Clamp-Pipetten aus einem 1 x 0,58 mm (OD x ID) Borosilikat-Filament mit Glaskapillaren. HINWEIS: Der Widerstand der Pipetten sollte bei der Verwendung von Intrazellulärlösung auf Kaliumglukonat-Basis (IS1) 8-15 MΩ betragen. Jeder geeignete Patchpipetten- Abzieher kann verwendet werden (zum Beispiel siehe Tabelle der Materialien ). Feuerpolieren ist nicht notwendig. Bereiten Sie eine Aufnahmekammer vor (siehe Abbildung 2 ), indem Sie ein Deckglas (siehe Tabelle der Materialien ) auf den Boden der Badkammer mit geschmolzenem Paraffin oder Hochvakuum-Silikonfett fixieren . Verwenden Sie eine geeignete hausgemachte oder kommerzielle Kammer, die Elektroden Zugang und Perfusion ermöglicht. Montiere das Bad auf der Bühne eines umgekehrten Mikroskops. Legen Sie das Perfusionssystem Rohr, Saug-System und Boden ( dh Ag-AgCl Draht / Pellet) in das Bad (siehe die Tabelle der Materialien und Abbildung 2 ). Legen Sie zwei Paare von feinen # 5 Pinzetten (Abbildung 1 ) auf die Arbeitsfläche für den Einsatz während der Retina Dissektion und ommatidia Isolation Schritte. 3. D. melanogaster Aufzucht Heben Sie D. Melanogaster fliegt bei einer niedrigen Bevölkerungsdichte ( dh 20 Fliegen in einer Flasche 6 Unzen) in Flaschen, die Standard-Maismehl-Nahrung bei 19-24 ° C enthalten. HINWEIS: Es ist vorzuziehen, an dunkel angepassten Fliegen zu arbeiten. Um eine hohe Lichtempfindlichkeit zu erhalten, reduzieren Sie die Vielfalt und verhindern die Netzhautdegeneration bei Mutantenfliegen. Hebe die Fliegen im Dunkeln für mindestens 24 Stunden vor dem Experiment an. ANMERKUNG: Die Fliegen, die für die Experimente verwendet werden, sollten rece(<2 h) und immer noch weich, blass zeigt das meconium. ommatidien kann auch leicht aus puppen vorbereitet werden, obwohl ihre lichtempfindlichkeit dann stark vom alter von 10 abhängig ist. 4. retina dissektion ommatidia isolation: option 1 hinweis: führen sie alle folgenden schritte unter dem stereoskopischen zoommikroskop mit einer verstärkung aus, die für eine ordnungsgemäße betrachtung der vorbereitung geeignet ist (siehe abbildung ). legen vier tropfen es-0ca 2+ einen ts-lösung auf 60-mm-petrischale, umgedreht wurde. groben pinzetten, fangen neu verpackt (<2 h nach eclosion) fliegen durch seine flügel oder körper. nehmen ab diesem zeitpunkt verfahren schnell dunklen rotation bei 20 ± ° c durch. während fliege rauen pinzette fassen, verwenden erste paar feine um den fliegenkopf körper zu lösen. submrge kopf in ersten tropfen. ziehen hälfte entlang sagittal-ebene zweiten pinzette. stellen sicher, dass am ende dieses schrittes beide augen intakt sind. Übertragen des kopfes andere dritten feinen pinzette, entfernen so viel gewebe auge wie möglich kein schaden an netzhaut verursacht wird. fassen rand hornhaut fest schaufeln scoop aus. anmerkung: beendigung wird leer gelassen, getrennt intakten netzhaut. spülen triturationspipette schlauch ddw füllen pipette kleinen menge vierten dieser schritt muss jedes mal durchgeführt wenn neue ommatidia-trennpipette verwendet entfernt wirdm ethanol-becher (die lösung, füllt, sollte lösung übereinstimmen, eingetaucht ist). vorsicht vorsichtig mund strecken, isolierte ziehen. äußerste vorsicht, keine luftblasen streben. ts. 4.6-4.10 zweite auge. wischen empfindlichen tüchern lassen nur ts, retinae enthält, petrischale. füge sechs weitere ts spitze retinas anderen ts-tropfen. ersetzen kleineren Öffnung. es 4.8 beschrieben, als füllen. wiederholt aspirieren verlaufen trennung isolierten ommatidien, pigmentzellen ganzen gestrippt wurden, beginnen. sind im ts-drop sichtbar, isolationsvorgang fortschreitet, ts-tropfen weniger lichtdurchlässig. verbleibenden zum nächsten ts-drop. ehemaligen (mit ommatidia) vervollständigen badkammer. wiederholen 4.12-4.14, maximal omatidien erreichen. warten ca. min, damit sinken boden badkammer binden kann. perfusionssystem fluss 1,5 mm ca starten. sicherstellen, kammer vollständig unten oben gefüllt weiter waschen badewanne 4-5x. 5. 2 zoom-mikroskop, einem ampligeeignet korrekte bereiten rasierklingen-chip halter vor. abbrechen montieren dreieckigen chip rasierklinge rasierklingenhalter (abbildung silikon-dissektion schüssel >

Representative Results

Das beschriebene Verfahren ermöglichte die genaue Aufzeichnung der fundamentalen Einheitsströme, die spontane und licht evozierte Quantenhöcker erzeugen, die die makroskopische Antwort auf Licht unter definierten Bedingungen erzeugen. Es erlaubte auch den Vergleich zwischen Wildtyp- und Mutantenfliegen, die Defekte in kritischen Signalmolekülen aufweisen ( Fig. 3 und 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Darüber hinaus zeigte die Fähigkeit, das Umkehrpotential unter bi-ionischen Bedingungen zu messen, grundlegende biophysikalische Eigenschaften der TRP- und TRP-ähnlichen (TRPL) Kanäle 18 , 19 . Es ermöglichte auch die Messung der Wirkungen von Aminosäuresubstitutionen in der Porenregion von TRP, die ihr Ca 2+ modifiziertenDurchlässigkeit 20 Die durch Patch-Clamp-Ganzzell-Aufnahmen erhaltene Lichtreaktion hängt linear von der Lichtintensität für mindestens 4 Größenordnungen ab. Dies konnte nicht durch die Verwendung von ERG- und intrazellulären Aufzeichnungsverfahren behoben werden. Dementsprechend zeigte eine Reihe von Antworten auf kurze Blitze mit zunehmender Intensität und einer Auftragung der Intensitätsantwortfunktion eine strenge Linearität der Blitzreaktion mit zunehmender Lichtintensität. Die strenge Linearität hält bis zu mindestens einigen hundert pA, aber es ist umstritten, ob es danach Linearität oder Klemmsteuerung ist, die bricht (Abbildung 6 ). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die makroskopischen Reaktionen auf Licht eine lineare Summierung der unitären Reaktionen auf Licht ( dh Quantenstöße) sind. Es wurde gut etabliert unter Verwendung von Spannungsaufzeichnungen, die Licht Stimulation indUces diskrete Spannungsschwankungen ( dh Quantenstöße) bei den meisten wirbellosen Arten. Die M. melanogaster Quantenbumps ergeben sich aus der konzertierten Öffnung von ~ 15 TRP Kanälen und ~ 2 TRPL Kanälen am Höhepunkt der Bump 18 . Jeder Stoß wird durch die Absorption eines einzelnen Photons erzeugt, während die makroskopische Reaktion auf intensivere Lichter die Summierung dieser elementaren Reaktionen 14 , 21 ist . Die Stöße variieren in Latenzzeit, Zeitverlauf und Amplitude, auch wenn die Stimulusbedingungen identisch sind. Die Bump-Generation ist ein stochastischer Prozess, der von der Poisson-Statistik beschrieben wird, wobei jedes effektiv absorbierte Photon nur einen Bump auslöst. Die Single-Photon-Single-Bump-Beziehung erfordert, dass jeder Schritt in der Kaskade nicht nur einen effizienten "Turn-On" -Mechanismus beinhaltet, sondern auch einen ebenso effektiven "Abschalt" -Mechanismus. Der funktionale Vorteil ist die Produktion vonSehr empfindlicher Photonenzähler mit einer schnellen Transientenreaktion, die sehr gut für die Empfindlichkeit und die zeitliche Auflösung des visuellen Systems geeignet ist. Die Anforderung an einen effizienten Abschaltmechanismus zeigt sich, wenn entweder das aktive Photopigment ( dh Metarhodopsin, M) oder sein Ziel, das G q α, nicht inaktiviert und zur kontinuierlichen Produktion von Stößen führt, lange nachdem das Licht ausgeschaltet ist ( Abb 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . Der Stoß stellt die kooperative Aktivität der TRP / TRPL-Kanäle in einem Mikrovillus dar. Als solche sollte jede Hypothese der Kanalaktivierung auch die Kooperationskanalaktivierung erklären. Vor kurzem haben Hardie und Kollegen gezeigt, dass Licht rasche Kontraktionen der Photorezeptoren hervorruft, was darauf hindeutet, dass das lichtempfindlicheE Kanäle (TRP / TRPL) können mechanisch gated werden 25 . Diese mechanische Aktivierung, zusammen mit den beobachteten Protonen, die durch PLC-vermittelte PIP 2- Hydrolyse freigesetzt werden, fördern die Öffnung der TRP / TRPL-Kanäle und erklären die Kooperationsart der Bump-Produktion 26 . Derzeit sind D. melanogaster Photorezeptoren eines der wenigen Systeme, in denen Phosphoinositide Signaling und TRP Kanäle in vivo untersucht werden können, so dass D. melanogaster Phototransduktion und die Methodik entwickelt, um diesen Mechanismus ein sehr wertvolles Modell-System zu studieren. Abbildung 3: Die inaC P209 und inaD P215 Mutanten zeigen die langsame Reaktion Beenden der makroskopischen Reaktion auf Licht und der einzelnen Quantenhöcker. ( A ) Die isolierte Ommatidium prepaRation mit einer Patchpipette, gefüllt mit fluoreszierendem Lucifer Yellow CH-Farbstoff (Anregung: 430 nm, Emission: 540 nm) wird während einer Ganzzell-Aufzeichnung präsentiert. Man beachte, daß der Fluoreszenzfarbstoff diffundiert und einen einzelnen Photorezeptorzellkörper markiert ist und daß die Photorezeptorzellkörper von ihren langgestreckten Axonen abgelöst werden, aber dennoch die Lebensfähigkeit beibehalten. Diese Vorbereitung eignet sich für gleichzeitige Ganzzell-Aufnahmen und Imaging-Experimente. ( BD ) Obere Panels: Ganzzellige Spannung geklemmte Quanten-Bump-Reaktionen auf kontinuierliches Dämmerlicht (offener Stab) in WT, InaC P209 und InaD P215 Mutantenfliegen . Eine langsame Beendigung der Beulen wird bei inaC P209 und inaD P215- Mutanten relativ zu WT-Fliegen beobachtet . Die Einfügung unten zeigt die vergrößerte Form der einzelnen Stöße. Bodenpaneele: Normalisierte Ganzzell-aufgezeichnete makroskopische Reaktionen auf einen 500-ms-Lichtpuls (1,5 x 10 5 Photonen pro s) des obigen Wildtyps Und mutierte Fliegen. (EG) Obere Panels: Ganzzellige Spannung geklemmte Quanten-Bump-Reaktionen auf ein kurzes (1 ms), schwaches Licht, das Einzelphotonenantworten in Wildtyp-, arr2 3- und ninaC P235-Mutantenfliegen auslöst . Beachten Sie den Zug der in arr2 3 und ninaC P235 beobachteten Bumps in Reaktion auf eine einzelne Photonenabsorption. Bodenplatten: Ganzzellige Spannung klemmte normalisierte Reaktionen auf einen 500 ms Lichtimpuls (1,5 x 10 4 Photonen / s) in den entsprechenden Mutanten. Beachten Sie die langsame Beendigung der makroskopischen Reaktionen, die in arr2 3 beobachtet wurden Und NinaC P235 Mutante fliegt relativ zu WT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. D / 55627 / 55627fig4.jpg "/> Abbildung 4: Zelluläre Ca 2+ -Dynamik nach dem signalinduzierten Ca 2+ -Influx wird von Calphotin beeinflusst. Eine Zeitreihe von Photorezeptor-Bildern von Wildtyp- und Cpn- 1% -Flügen, die die Fluoreszenz des Ca 2+ -Analys während der Lichtstimulation zeigen. Rohfarbbilder werden mit Falschfarbenkodierung aufgetragen (bar = 10 μm, Pfeilspitzen geben die Pipette an). Bild nachgedruckt mit Genehmigung von Weiss et al. 4 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 5: Die elektrophysiologischen Eigenschaften von WT, trp und trpl Mutanten. ( A ) Ganzzellspannungsklemme recoRings von Quantenstößen in Reaktion auf kontinuierliches schwaches Licht (offener Stab) in WT, trpl 302 und trp P343 Nullmutantenfliegen. Es werden sehr reduzierte Amplituden von trp P34 3 Beulen beobachtet. Inset: Vergrößerte Einzelquantenstöße von Wildtyp und trp P343 null Mutantenfliegen werden gezeigt. ( B ) Ganzzellige Spannungsklemmenaufnahmen in Reaktion auf einen 3 s Lichtpuls des Wildtyps und die entsprechenden Mutanten. Die transiente stationäre Reaktion der trp- P343- Mutante wird beobachtet. Inset: Vergrößerte Lichtreaktionen von WT und trp P343 Mutanten werden gezeigt. ( C ) Eine Familie von überlagerten lichtinduzierten Strömen der obigen Fliegendehnungen, die in Reaktion auf einen 20 ms-Lichtimpuls bei Spannungsschritten von 3 mV, gemessen um das Umkehrpotential (E rev ), hervorgerufen wurden. ( D ) Ein Histogramm, das die mittlere E rev des Wildtyps und die verschiedenen Mutanen darstelltTs Die Fehlerbalken sind die SEM Das Umkehrpotential (E rev ) von WT liegt zwischen dem positiven E rev von trpl 302 , das nur TRP exprimiert, und die E rev der trp P343 Nullmutante, die nur TRPL ausdrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 6: Die Flash-Antwort ist streng linear mit zunehmender Lichtintensität. Eine Reihe von aktuellen Reaktionen auf kurze Blitze der zunehmenden Lichtintensität und eine Auftragung der Abhängigkeit der Spitzenamplitude der Lichtreaktion auf die zunehmende Intensität der kurzen Lichtblitze blinkt. Diese Beziehung zeigt eine strikte Linearität zwischen der Blitzreaktion und der zunehmenden Lichtintensität. Diese strenge LinearitätBis zu mindestens einigen hundert pA, mit Lichtintensität über 4 Größenordnungen, während es umstritten ist, ob es Linearität oder die Klemmensteuerung ist, die danach zerbricht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. PH-Wert 7.15 (mit NaOH einstellen) Reagens Konzentration (mM) NaCl 120 KCl 5 MgCl & sub2 ; 4 TES 10 Proline 25 Alanin 5 Bei -20 ° C aufbewahren. <td colspan= "2"> Hinweis: Diese Lösung ist nominell Ca 2+ frei, hat aber keine Ca 2+ Puffer und wird daher ca. 5 – 10 μM Trace Ca 2+ haben . Extrazelluläre Lösung (ES) = ES-0Ca 2+ mit 1,5 mM CaCl 2 , hergestellt durch Zugabe von CaCl 2 aus einer 0,5 oder 1 M Stammlösung zu ES-0Ca 2+ . Tabelle 1: Ca + 2 -freie extrazelluläre Lösung (ES). Chemische Beschreibung und die spezifischen Mengen, die zur Herstellung von Ca +2- freie ES erforderlich sind. Reagens Menge FBS 15 ml Saccharose 1,5 g In 150 μl Aliquots in 1,5 mL Fläschchen teilen und bei -20 lagern 76; Triturierungslösung (TS) Füllen Sie 1 Durchstechflasche mit 150 ml der Stammlösung mit 1.350 ml ES oder ES-0Ca 2+ , um die bei der Dissektion verwendete Lösung zu erfüllen. Tabelle 2: Fetales Rinderserum (FBS) + Saccharose – Lagerlösung. Chemische Beschreibung und die spezifischen Mengen, die zur Herstellung von fötalem Rinderserum (FBS) + Saccharose – Stammlösung erforderlich sind. PH-Wert 7.15 (mit KOH einstellen) Reagens Konzentration (mM) Kaliumglukonat (Kglu) 140 MgCl & sub2 ; 2 TES 10 ATP-Magnesiumsalz (MgATP) 4 GTP-Natriumsalz (Na 2 GTP) 0,4 Β-Nicotinamid-adenindinucleotidhydrat (NAD) 1 Bei -20 ° C aufbewahren. Tabelle 3: Intrazelluläre Lösung (IS1). Chemische Beschreibung und die spezifischen Mengen, die zur Herstellung von IS1 erforderlich sind, die meist für Intensitätsreaktionen und Quantenstoßmessungen verwendet werden. PH-Wert 7.15 (mit CsOH einstellen) Reagens Konzentration (mM) CsCl 120 MgCl & sub2 ; 2 TES 10 ATP-Magnesiumsalz (MgATP) 4 GTP-Natriumsalz (Na 2 GTP) 0,4 Β-Nicotinamid-adenindinucleotidhydrat (NAD) 1 Tetra-ethylammoniumchlorid (TAE) 15 Bei -20 ° C aufbewahren. Tabelle 4: Intrazelluläre Lösung (IS2). Chemische Beschreibung und die spezifischen Mengen, die zur Herstellung der intrazellulären Lösung IS2 erforderlich sind, die meistens für Umkehrpotentialmessungen des lichtinduzierten Stroms verwendet wird.

Discussion

Die Anwendung von Ganzzell-Aufnahmen auf D. melanogaster Photorezeptoren erlaubte die Entdeckung und die funktionelle Aufklärung von neuartigen Signalproteinen wie TRP-Kanälen 27 , 28 , 29 und INAD 30 , 31 , 32 Gerüstprotein. Seit der ersten Einführung dieser Technik ermöglichte es die Auflösung von langfristigen Grundfragen bezüglich des Ionenmechanismus und der Spannungsabhängigkeit der Lichtreaktion. Dies geschah aufgrund der verliehenen Fähigkeit, die Membranspannung und die extrazelluläre und intrazelluläre ionische Zusammensetzung 19 , 28 genau zu steuern.

Ein großes Hindernis der Patch-Clamping-Technik in D. melanogaster war die Zerbrechlichkeit der isolierten ommatidia prepaRation. Detaillierte Untersuchungen haben ergeben, dass die Integrität der Phototransduktionsmaschinen kritisch von der kontinuierlichen Versorgung von ATP abhängt, insbesondere bei der Belichtung, was zu einem großen Verbrauch an ATP führt. Leider beseitigt die mechanische Streifenung der Pigment- ( dh Glia) -Zellen, die mit der Patchpipette zur Photorezeptormembran gelangen muss, die Hauptquelle der für die ATP-Produktion notwendigen Metaboliten 33 . Die Anwendung von exogenem ATP in die Aufzeichnungspipette erfüllt nur teilweise die Forderung nach großen Mengen an ATP. Eine kurze Versorgung mit ATP führt zu einer spontanen Aktivierung der TRP-Kanäle und zur Dissoziation der Phototransduktionsmaschinerie aus den lichtaktivierten Kanälen, was zu einer starken Zunahme des zellulären Ca 2+ und der Abschaffung der normalen Reaktion auf das Licht 34 , 35 führt . Diese Folge von Ereignissen ist nicht auf Schäden an derPhotorezeptoren durch das Sektionsverfahren, sondern vielmehr die zelluläre Erschöpfung von ATP. Um zu verhindern, dass diese Folge von Ereignissen auftritt und normale Lichtreaktionen aufrechterhalten wird, sollten die Photorezeptoren nicht intensiven Lichtern ausgesetzt werden, die große Mengen an ATP verbrauchen. Auch muss NAD in die Aufzeichnungspipette aufgenommen werden, vermutlich um die ATP-Produktion in den Mitochondrien 18 , 36 zu erleichtern. Für Messungen von Spontan- und Quantenstößen ist die obige Schwierigkeit minimal, da nur schwache Lichter verwendet werden. In der Praxis kann eine stabile Ganzzell-Aufzeichnung für ~ 20-25 min aufrechterhalten werden, obwohl es eine Tendenz gibt, dass die Reaktionskinetik über diesen Zeitraum verlangsamt wird. Eine einmalige Vorbereitung der dissoziierten Ommatidien kann bis zu 2 h lebensfähig bleiben.

Ein zusätzliches Manko der isolierten Ommatidienpräparation ist die Unzugänglichkeit der Mikrovilli, was auf die Unzugänglichkeit der TRP undTRPL-Kanäle zur Aufzeichnungspipette, die Einkanal-Aufnahmen verhindern. Mit einer von ihnen entwickelten Methode gelang es Bacigalupo und Kollegen, die Einkanal-Aktivität aus dem Rhabdomere direkt zu erfassen 37 . Jedoch unterscheidet sich diese Kanalaktivität von der von TRPL-Kanälen, die heterolog in den Gewebekulturzellen 38 exprimiert wurden, und von der TRP-Kanalaktivität, die aus der aus der isolierten Omatidia 34 erhaltenen Schussgeräuschanalyse abgeleitet ist. Vermutlich hat das Dissektionsverfahren die Photorezeptorzellen bei der Verwendung dieses Verfahrens stark beschädigt.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Der experimentelle Teil dieser Forschung wurde durch Stipendien der US-Israel Bi National Science Foundation (BM und IL), der Israel Science Foundation (ISF), der Deutsch-Israelischen Projektkooperation (DIP) (bis BM) und der Biotechnologie unterstützt Und Biological Sciences Research Council (BBSRC Grant Zahlen: BB / M007006 / 1 und BB / D007585 / 1) zu RCH

Materials

10 ml syringe
5 ml syringe
1 ml syringe with elongated tip
Petri dish 60 mm
Silicone dissection dish/block Dow Corning Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter 
Capillaries (for omatidia separation) Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)
Polyethylene Tubing Becton Dickinson 1.57 x 1.14 mm (35 cm)
 2 small beakers 50 ml or less
2 paraffin film sheets Parafilm M ~5 x 5 cm
Bath chamber home made
Cover slips 22 x 22 mm No. 0
Paraplast Plus Sigma Paraffin – polyisobutylene mixture To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber
Ground Warner Instruments  64-1288 Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly
Headless micro dissection needle Entomology, 12 mm
Micro dissecting needle holder
Vise
2 fine tweezers + 1 rough tweezers Dumont #5, Biology  0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox
Stereoscopic zoom Microscope  Nikon SMZ-2B
Cold light source Schott KL1500 LCD
Filter (Color) for cold light source Schott RG620
Delicate wipers Kimtech Kimwipes
Electrode holder Warner Instruments QSW-T10P Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style
Silver Wire Warner Instruments 0.25 mm diameter, needs to be chloridized
Micromanipulator Sutter Instruments MP 85 Huxley-Wall Style Micromanipulator
Faraday cage home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01
Osilloscope GW GOS-622G
Perfusion system Warner Instruments VC-8P Pinch valve control system
Perfusion valve controller Scientific instruments BPS-8
Suction system
Amplifier Molecular Device Axopatch-1D
Head-stage Molecular Device CV – 4 Gain: x 1/100
A/D converter Molecular Device Digidata 1440A
Clampex Molecular Device 10 software
pCLAMP Molecular Device 10 software
Light source (Xenon Arc lamp) Sutter Instruments Lambda LS
Light detector home made phototransistor
Filter wheel and shutter controller Sutter Instruments Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter
Filters (Natural density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElecftronic JML-C2
Light guide Quartz 
Pulse generator AMPI Master 8
Microscope Olympus IX71, Inverted
Red illumination filter (Microscope) RG630 / RG645 ø45mm
Microscope objective Olympus X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil
CCD Camera Andor iXon DU885K
NIS Element  Nikon AR software
Ca+2 indicator Invitrogen Calcium green 5N
Excitation & emission filters and dichroic mirror Chroma 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set
Vertical pipette puller Narishige  Model PP83 Use either vertical or horizontal puller, as preferred.
Horizontal pipette puller Sutter Instrument  Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller
Filament Sutter Instrument 3 mm trough or square box
Capillaries Harvard Apparatus borosilicate glass capillaries 1 x 0.58 mm
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Referenzen

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Keywords: ElectrophysiologyWhole-cell Voltage ClampDrosophilaPhotoreceptorsPhototransductionTRP ChannelsVisual TransductionDissectionCalcium-free Extracellular SolutionInverted MicroscopePerfusion SystemSuction SystemGround WireElectrophysiology Setup
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Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (124), e55627, doi:10.3791/55627 (2017).
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