Summary

Elektrofysiologisk metode til hele celle spænding clamp optagelser fra<em> Drosophila</em> Photoreceptors

Published: June 13, 2017
doi:

Summary

Helecelleoptagelser fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer muliggør måling af spontane mørke humper, kvantebumps, makroskopiske responser til lys og aktuelle spændingsforhold under forskellige forhold. I kombination med D. melanogaster genetiske manipulationsværktøjer muliggør denne metode undersøgelsen af ​​den allestedsnærværende inositol-lipid-signalvej og dens mål, TRP-kanalen.

Abstract

Hele celle spænding clamp optagelser fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer har revolutioneret området for invertebrat visuel transduktion, hvilket muliggør brugen af D. melanogaster molekylær genetik til at studere inositol-lipid signalering og transient receptor receptor potentielle (TRP) kanaler på single-molekylen niveau. En håndfuld laboratorier har mestret denne kraftfulde teknik, som gør det muligt at analysere de fysiologiske reaktioner på lys under højt kontrollerede forhold. Denne teknik tillader kontrol over det intracellulære og ekstracellulære medium; Membranspændingen; Og hurtig anvendelse af farmakologiske forbindelser, såsom en række ioniske eller pH-indikatorer, til intra- og ekstracellulære medier. Med et usædvanligt højt signal-til-støjforhold gør denne metode det muligt at måle mørke spontane og lysinducerede enhedsstrømme ( dvs. spontane og quantum humle) og makroskopiske lysinducerede strømme (LIC) fra syndGle D. melanogaster fotoreceptorer. Denne protokol beskriver detaljeret alle de vigtigste trin, der er nødvendige for at udføre denne teknik, som omfatter både elektrofysiologiske og optiske optagelser. Flyvehindehindefordelingsproceduren til opnåelse af intakt og levedygtig ex vivo- isoleret ommatidia i badekammeret er beskrevet. Det udstyr, der er nødvendigt for at udføre helcelle- og fluorescensbilledmålinger, er også detaljerede. Endelig forklares faldgruberne ved brug af dette delikate præparat under udvidede eksperimenter.

Introduction

Omfattende genetiske undersøgelser af frugtflyve , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , der blev indledt for mere end 100 år siden, har etableret D. melanogaster- flyve som en yderst nyttig eksperimentel model til genetisk dissektion af komplekse biologiske processer. Den nedenfor beskrevne metode kombinerer den akkumulerede effekt af D. melanogaster molekylær genetik med det høje signal-til-støjforhold for fuldcelle patch clamp-optagelser. Denne kombination muliggør undersøgelsen af D. melanogaster- fototransduktion som en model for inositol-lipid-signalering og TRP-kanalregulering og -aktivering både i det oprindelige miljø og ved den højeste opløsning af enkeltmolekyler.

Anvendelse af helcelleoptagelsesmetoden til D. melanogaster fotoreceptorer har revolutioneret undersøgelsen af ​​invertebratfototransduktion. Denne metode blev udviklet af Hardie 1 og indepEndelig af Ranganathan og kolleger for 2 ~ 26 år siden og var designet til at udnytte de omfattende genetiske manipulationsværktøjer af D. melanogaster og bruge dem til at afdække mekanismer for fototransduktion og inositol-lipid signalering. I starten led denne teknik af en hurtig reduktion i lysfølsomhed og et lavt udbytte af ommatidier under dissektionsprocessen, hvilket forhindrede detaljerede kvantitative undersøgelser. Senere øgede tilsætningen af ​​ATP og NAD til patchpipetten dramatisk hæftelsen af ​​præparatet til længerevarende kvantitative optagelser. Derefter blev omfattende karakterisering af signaltransduktionsmekanismen på molekylniveau realiseret.

I øjeblikket er D. melanogaster- fototransduktion et af de få systemer, hvor phosphoinositidsignalerings- og TRP-kanaler kan studeres ex vivo ved enkeltmolekylopløsning. Dette gør D. melanogaster fototransduktion og migThodology udviklet til at studere denne mekanisme et meget følsomt modelsystem. Denne protokol beskriver, hvordan man dissekerer D. melanogaster retina og mekanisk striper den isolerede ommatidia fra de omgivende pigment (glia) celler. Dette muliggør dannelsen af ​​en giga-tætning og en helcelle patch klemme på fotoreceptor celle legemer. Heldigvis er de fleste signalproteiner begrænset til rhabdomere og diffunderer ikke. Derudover er der en immobil Ca 2+ buffer kaldet calphotin, der er placeret mellem signalkammeret og cellekroppen 3 , 4 og et højt ekspressionsniveau for Na + / Ca 2+ -veksleren (CalX) i mikrovilli 5 . Sammen giver proteinindeslutning til rhabdomeren, calphotin-bufferen og den høje ekspression af CalX mulighed for relativt langvarig ( dvs. op til ~ 20 min) helcelleoptagelser uden tab af væsentlige komponenterAf fototransduktionsprocessen og samtidig opretholde høj følsomhed over for lys. Den følgende protokol beskriver, hvordan man får isoleret ommatidia og udfører helcelleoptagelser, der synes at bevare fototransduktionskaskadens native egenskaber. Hele-celle patch clamp eksperimenter på dissocieret kakerlak ( Periplaneta americana ) 6 og cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia blev udført tilsvarende som beskrevet for D. melanogaster . Desuden blev patch clamp eksperimenter på dissocierede fotoreceptorer af filen clam, ( Lima scabra ) og jakobsmuslinger ( Pecten irradians ) udført på en lidt anden måde end den, der blev udført på D. melanogaster , hvilket tillader både helcelle 8 og enkeltkanal målinger 9 . Her beskrives de vigtigste resultater opnået i D. melanogaster under anvendelse af denne teknik. Diskussionen iHerunder beskrivelse af nogle faldgruber og begrænsninger af denne teknik.

Protocol

1. Reagensfremstilling BEMÆRK: Forbered alle løsninger i overensstemmelse med instruktionerne i tabel 1-4 . Fyld en 10 ml sprøjte med ekstracellulær opløsning (ES eller ES-0Ca 2+ , efter behov, se tabel 1 ) og opbevar den på is. Forbered et hætteglas med triturationsopløsning (TS, se tabel 2 , dvs. ES eller ES-0Ca 2+ + FBS og saccharose) og opbevar dette på is. Forbered tilstrækkeligt ES til eksperimentet, og hold det på is indtil det er nødvendigt. BEMÆRK: Kontinuerlig badperfusion er ikke nødvendig, så mængden af ​​ES behøver ikke være mere end et par dusin ml. Ved anvendelse af et 22 μm PVDF-filter skal den intracellulære opløsning (se tabel 3 eller tabel 4 ) indsættes i en 1 ml sprøjte med en elektrodfyldning aflænget spids. Opbevar dette på is. 2. Generel opsætning af Dissecting Tools <p class="Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figur 1: Værktøjer og enheder, der er nødvendige for at gøre den isolerede Ommatidia-forberedelse. Billederne viser de forskellige enheder, der kræves til at skabe det isolerede ommatidia-præparat, som beskrevet i den detaljerede protokol ovenfor. To bægerstykker, en fyldt med vand ( A ) og den anden fyldt med ethanol ( B ) til rengøring af triturationspipetterne ( D ), der er forbundet med slangen ( C ). Dissektionsværktøjerne er: 2 par fine og 1 par grove pincet ( F ) og en nethinden scooper ( E ). For at forberede retina scooper presses en mikrotissionsnål ( H ) mellem to drejeværktøjer, der virker som en skrue ( G ) for at flette toppen af ​​nålen ( I ). Så er det forbundet med en langstrakt pi Ece af metal ved hjælp af lim ( J ) og monteret på en nåleholder ( E ). Razor blade chip og holder: Afbryd og monter en lille trekantet chip af et barberblad med en knivholder ( K ). Dissektionsarbejdsområdet er sammensat af en kikkert ( L ) og en kølig rød lyskilde (( M) ) med to lyskaster ( N ). Disseksionsværktøjerne, herunder pincett ( F ), nethinden scooper ( E ), bæger ( A og B ), en lommelygte med et rødt filter ( Q ) og delikate viskere ( R ) er anbragt på begge sider af kikkerten. En isspand med ES, FBS-ES, intracellulære opløsningssprøjter, 60 mm petriskålen ( S ) og elektrodeholderen ( P ) er også anbragt på bordet. Optagelektroderne trækkes ved hjælp af en vandret træk ( T ).E.com/files/ftp_upload/55627/55627fig1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur. Konstruer en retina scooper for at isolere retinae. Indsæt punktet (1-4 mm) af en mikrotissionsnål (entomologisk nål, 12 mm længde, 0,1 mm diameter) mellem de to skruer og flad den ved at tappe med en lille hammer. Monter den udfladte nål på en mikrodisksnålholder (se Materialebordet ). Ved hjælp af et par pincet buer du den nipede ende af nålen for at danne en krog med en krumning på ~ 2,5 mm. Opret trituration pipetter til ommatidia adskillelse. Placer en glasplade på 1,2 x 0,68 mm (OD x ID) over en åben flamme og brand poler for at reducere åbningen. Mål kapillærens åbning under et mikroskop. Sorter de dannede ommatidiale trituration pipetter i seveN grupper efter størrelsen af ​​deres åbninger ( dvs. 0,2-0,5 mm). Opbevar dem i separate egnede beholdere ( f.eks. Reagensglas). Fyld et lille bægerglas med dobbeltdestilleret vand (DDW) og et andet lille bæger med ethanol 70%. Dæk hvert bægerglas med et parafinfilmark. Stans et lille hul i paraffinfilmpladen, der dækker DDW-bægeret (se figur 1A ). Punch syv små huller i paraffinfilmarket, der dækker ethanolbægeret og nummer hullerne fra 0 til 6 (se figur 1B ). Placer en ommatidisk triturationspipette fra hver størrelsesgruppe i hvert parafinfilmhul, således at pipetten med den største åbning er placeret i 0 hullet, og pipetten med den mindste åbning er placeret i det 6. hul. Tilslut en 200 μL pipettespids af plast til en 35 cm lang, 1,57 x 1,14 mm (OD x ID) stykke polyethylenrør. forbinT den anden ende af slangen til en af ​​de ommatidiale triturationspipetter med den største åbning ( dvs. 0,46-0,5 mm), hvilket sikrer, at den spidsede ende af triturationspipetten ikke vender ind i slangen. Klargør pipetter med hele celleoptagelsen ved at trække patch clamp pipetter fra et 1 x 0,58 mm (OD x ID) borosilicatfilament indeholdende glaskapillærer. BEMÆRK: Modstanden af ​​pipetterne skal være 8-15 MΩ, når der anvendes kaliumgluconatbaseret intracellulær opløsning (IS1). Enhver egnet patchpipetteafspiller kan bruges (for eksempel se Materialebordet ). Brandpolering er ikke nødvendig. Klargør et optagekammer (se figur 2 ) ved at fastgøre et dækslip (se Materialetabellen ) til bunden af badekammeret ved brug af smeltet paraffin eller højvakuum siliconefedt . Brug ethvert egnet hjemmelavet eller kommercielt kammer, der tillader elektrodadgang og perfusion. Monter badet på scenen af ​​et inverteret mikroskop. Placer perfusionssystemrøret, sugesystemet og jorden ( dvs. Ag-AgCl wire / pellet) i badet (se Materialebordet og Figur 2 ). Placer to par fine # 5 pincet ( figur 1 ) på arbejdsfladen til brug under retina dissektion og ommatidia isoleringstrin. 3. D. melanogasterbearbejdning Hæve D. Melanogaster flyver med en lav befolkningstæthed ( dvs. ~ 20 flyver i en 6 oz flaske) i flasker indeholdende standard majsmelmad ved 19-24 ° C. BEMÆRK: Det er at foretrække at arbejde på mørk-tilpassede fluer. For at opretholde høj følsomhed over for lys reducere mangfoldigheden og forhindre retinal degeneration i mutant fluer. Bag flyene i mørket i mindst 24 timer før forsøget. BEMÆRK: De fluer, der anvendes til forsøgene, skal være receNtly eclosed (<2 h) og stadig blød, bleg vise meconium. ommatidia kan også let fremstilles fra pupper, selvom deres følsomhed over for lys er så kraftigt afhængig af alderen 10 . 4. retina dissektion isolation: mulighed 1 bemÆrk: udfør alle de følgende trin under stereoskopisk zoommikroskop ved hjælp en forstærkning, som egnet til korrekt visning præparatet (se figur ). anbring fire dråber es-0ca 2+ dråbe ts-løsning på 60 mm petriskål, der blevet vendt. grove pincet, fange nyligt lukket (<2 h efter eclosion) flyve med sine vinger eller krop. dette tidspunkt skal du udføre procedurer hurtigt svagt rød belysning 20 ± ° c. mens tager fat i fluen bruge det første par fine pincet at løsne flyvehovedet kroppen. submerge hovedet den dråbe. dissect halvt langs sagittalplanet andet pincet. sørg for, begge øjne slutningen ​​dette intakte. overfør ene halvdel anden tredje brug fjern meget vævet, omgiver øjet muligt, ikke sker skade nethinden. tag kanten ​​en hornhinde skub ud nethinden scooperen. afslutningen vil hornhinden blive efterladt tom intakt, adskilt et intakt skyl triturationspipetten tilsluttet slangen ddw fyld pipetten lille mængde fjerde udføres hver gang ny ommatidia-separerende pipette anvendes fjernes fram ethanolbægeret (opløsningen fylder svare opløsning, hvor nedsænket). forsigtigt aspirere gennem munden trække isolerede ind pipetten. ekstrem forsigtighed strække luftbobler dråben ​​ts. 4.6-4.10 øje. tør dråberne væk sarte vådeservietter, lad kun ​​ts indeholde retinae petriskålen. tilsæt seks flere ts toppen ​​petri-skålen. retinas ​​de andre ts-dråber. udskift åbning mindre diameter. beskrevet 4.8, opløsning fylde sug gentag hurtig gentagne gange opløsningen begynde adskillelsen ​​isolerede ommatidier, strippet pigmentceller hele synlige ts-dråben, efterhånden isoleringsprocessen skrider frem, bliver ts-dråben gennemskinnelig. resterende næste drop. tidligere ts-dråbe (indeholdende ommatidia) udløb badekammeret. 4.12-4.14 opnå maksimal isoleret ommatidia. vent ca. min lade synke binde bunden ​​badekammeret. perfusionssystemet starter strømmen ​​es-0ca 1,5 ca kammeret fuldstændigt fyldt opløsningen, bund top, jorden helt nedsænket opløsningen. fortsæt vaske badet 4-5x. 5. 2 bemærk: stereoskopiske amplification forbered knivskarv holder. afbryd monter triangulær chip barberblad barberbladholder ( silikondisseksionsskål >

Representative Results

Den beskrevne metode har muliggjort den nøjagtige registrering af de grundlæggende enhedsstrømme, som genererer spontane og lysfremkaldte kvantebumps, som summen producerer det makroskopiske respons på lys under definerede betingelser. Det tillod ligeledes sammenligningen mellem vildtype og mutant fluer, der har defekter i kritiske signalmolekyler ( figur 3 og 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Desuden afslørede evnen til at måle reverseringspotentiale under bi-ioniske forhold de grundlæggende biofysiske egenskaber af TRP- og TRP-lignende (TRPL) kanalerne 18 , 19 . Det muliggjorde også måling af virkningerne af aminosyresubstitutioner i poreområdet af TRP, der modificerede dets Ca 2+Permeabilitet 20 . Det lysrespons, der opnås ved hjælp af patchclamp-helcelleoptagelser afhænger lineært af lysintensiteten i mindst 4 størrelsesordener. Dette kunne ikke løses ved hjælp af ERG og intracellulære optagelsesmetoder. Følgelig afslørede en serie af reaktioner på korte blinkninger med stigende intensitet og en plot af intensitetsresponsfunktionen en streng linearitet af flashresponset med stigende lysintensitet. Den strenge linearitet varer op til mindst flere hundrede pA, men det er diskutabelt, om det derefter er linearitet eller klemkontrol, der bryder sammen ( figur 6 ). Disse resultater tyder på, at de makroskopiske responser på lys er en lineær opsummering af de ensartede responser til lys ( dvs. kvantumstød). Det har været veletableret ved brug af spændingsoptagelser, som dæmper lysstimulering indUces diskrete spændingsudsving ( dvs. kvantebump) hos de fleste hvirvelløse arter. D. melanogaster kvantebumpene skyldes den samordnede åbning af ~ 15 TRP kanaler og ~ 2 TRPL kanaler ved toppen af ​​bumpen 18 . Hver bump genereres ved absorptionen af ​​en enkelt foton, mens det makroskopiske svar på mere intense lys er summationen af ​​disse elementære reaktioner 14 , 21 . Bumpene varierer betydeligt i latens, tidskurs og amplitude, selvom stimulusbetingelserne er ens. Bump generation er en stokastisk proces beskrevet af Poisson statistikker, hvor hver effektivt absorberet foton udløser kun en bump. Single-foton-enkelt-bump forholdet kræver, at hvert trin i kaskade ikke kun omfatter en effektiv "turn-on" mekanisme, men også en lige så effektiv "off-off" mekanisme. Den funktionelle fordel er produktionen af ​​aMeget følsom fotonetæller med et hurtigt forbigående svar, der er meget velegnet til både følsomheden og den tidsmæssige opløsning, der kræves af det visuelle system. Kravet om en effektiv afbrydningsmekanisme er afsløret, når enten den aktive fotopigment ( dvs. metarhodopsin, M) eller dens mål, G q α, ikke inaktiverer og fører til kontinuerlig produktion af bump, langt efter at lyset er slukket ( figur 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . Bumpen repræsenterer TRP / TRPL-kanalernes kooperative aktivitet i en microvillus. Som sådan bør enhver hypotese af kanalaktivering også forklare kooperativ kanalaktivering. For nylig har Hardie og kolleger vist at lys fremkalder hurtige sammentrækninger af fotoreceptorerne, hvilket tyder på, at lysfølsomE-kanaler (TRP / TRPL) kan være mekanisk indhegnet 25 . Denne mekaniske aktivering, sammen med de observerede protoner frigivet ved PLC-medieret PIP 2- hydrolyse, fremmer åbningen af ​​TRP / TRPL-kanalerne og forklarer kooperativets karakter af bumpproduktion 26 . I øjeblikket er D. melanogaster fotoreceptorer et af de få systemer, hvor phosphoinositidsignalerings- og TRP-kanaler kan studeres in vivo , hvilket gør D. melanogaster- fototransduktion og den metodologi, der udvikles til at studere denne mekanisme et yderst værdifuldt model system. Figur 3: InaC P209 og inaD P215 mutanter afslører langsomme reaktionsterminering af det makroskopiske respons til lys og af enkeltkvantumbumpene. ( A ) Den isolerede ommatidiumprepaRation med en patchpipette fyldt med fluorescerende Lucifer Yellow CH farvestof (excitation: 430 nm, emission: 540 nm) præsenteres under en helcelleoptagelse. Bemærk, at det fluorescerende farvestof diffunderede og mærkede en enkelt fotoreceptorcellekrop, og at fotoreceptorcellekropperne løsnes fra deres aflange axoner, men stadig opretholder levedygtighed. Dette præparat er egnet til samtidige helcelleoptagelser og billeddannelsesforsøg. ( BD ) Øvre paneler: Hele celle spænding clamped quantum bump responser til kontinuerlig dim lys (åben bar) i WT, inaC P209 og inaD P215 mutant fluer. En langsom afslutning af humperne observeres i inaC P209 og inaD P215 mutanter i forhold til WT fluer. Indsnittet nedenfor viser den forstørrede form af enkeltstød. Bundpaneler: Normaliserede helcelle optagne makroskopiske reaktioner på en 500 ms lyspuls (1,5 x 10 5 fotoner pr s) af ovennævnte vildtype Og mutant fluer. (EG) Øvre paneler: Hele celle spænding clamped quantum bump svar på en kort (1 ms), svagt lys fremkalde single-foton svar i vildtype, arr2 3 og ninaC P235 mutant fluer. Bemærk trinet af humle observeret i arr2 3 og ninaC P235 mutant fluer som reaktion på en enkelt fotonabsorption. Bundpaneler: Hele-celle spænding fastspændte normaliserede reaktioner på en 500 ms lyspuls (1,5 x 104 fotoner / s) i de tilsvarende mutanter. Bemærk den langsomme afslutning af de makroskopiske reaktioner, der observeres i afsnit 2 Og ninaC P235 mutant fluer i forhold til WT. Klik her for at se en større version af denne figur. D / 55627 / 55627fig4.jpg "/> Figur 4: Cellulær Ca 2+ -dynamik Følgende signal-induceret Ca 2+ -tilstrømning påvirkes af Calphotin. En tidsserie af fotoreceptorbilleder af vildtype og Cpn 1% fluer viser fluorescensen af ​​Ca 2+ -indikatoren under lysstimulering. Råintensitetsbilleder tegnes ved hjælp af falskfarvekodning (bar = 10 μm; pilehoveder angiver pipetten). Figur genoptrykt med tilladelse fra Weiss et al. 4 . Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 5: De elektrofysiologiske egenskaber af WT-, trp- og trpl-mutanter. ( A ) Helecelle spændingsklemme recoRdings af quantum bumps som svar på kontinuerlig dim lys (åben bar) i WT, trpl 302 og trp P343 null mutant fluer. Meget reducerede amplituder af trp P34 3 bump observeres. Inset: Forstørrede single quantum bumps af wildtype og trp P343 null mutant fluer vises. ( B ) Wholecelle spændingsklemmeoptagelser som reaktion på en 3 s lyspuls af vildtype og de tilsvarende mutanter. Det forbigående steady state respons af trp P343 mutanten observeres. Inset: Forstørrede lysresponser af WT og trp P343 mutant er vist. ( C ) En familie af overlejrede lysinducerede strømme af ovennævnte fluestammer, fremkaldt som reaktion på en 20 ms lyspuls ved spændingstrin på 3 mV målt omkring reverseringspotentialet (E rev ). ( D ) Et histogram der udformer den gennemsnitlige E rev af vildtype og de forskellige mutanerts. Fejlstængerne er SEM Vendingspotentialet (E rev ) for WT er mellem den positive E rev for trpl 302 , som kun udtrykker TRP og E rev for trp P343 null mutanten, som kun udtrykker TRPL. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 6: Flash-responsen er strengt lineær med stigende lysintensitet. En serie af aktuelle reaktioner på korte blinkninger af stigende lysintensitet og et plot af afhængigheden af ​​toppamplituden af ​​lysresponsen på den stigende intensitet af korte lysflammer. Dette forhold afslører en streng linearitet mellem flash respons og stigende lysintensitet. Denne strenge linearitetRummer op til mindst flere hundrede pA, med lysintensitet på over 4 størrelsesordener, mens det er diskutabelt, om det er linearitet eller klemkontrol, der bryder ned derefter. Klik her for at se en større version af denne figur. pH 7,15 (juster med NaOH) Reagens Koncentration (mM) NaCl 120 KCI 5 MgCl2 4 TES 10 Proline 25 alanin 5 Opbevares ved -20 ° C. <td colspan= "2"> Bemærk: Denne opløsning er nominelt Ca 2+ fri, men har ingen Ca 2+ buffere tilsat og vil derfor have ca. 5 – 10 μM spor Ca 2+ . Ekstracellulær opløsning (ES) = ES-0Ca 2+ med 1,5 mM CaCl2 fremstillet ved at tilsætte CaCl2 fra en 0,5 eller 1 M stamopløsning til ES-0Ca 2+ . Tabel 1: Ca + 2- fri ekstracellulær opløsning (ES). Kemisk beskrivelse og de specifikke mængder, der kræves for at producere Ca +2- fri ES. Reagens Beløb FBS 15 ml saccharose 1,5 g Opdel i 150 μl alikvoter i 1,5 ml hætteglas og opbevar ved -20 76; C. Triturationsopløsning (TS) Fyld 1 hætteglas med 150 ml stamopløsning med 1.350 ml ES eller ES-0Ca 2+ for at matche den opløsning, der blev brugt under dissektionen. Tabel 2: Fetal bovint serum (FBS) + saccharose-stamopløsning. Kemisk beskrivelse og de specifikke mængder, der kræves til fremstilling af føtalt bovint serum (FBS) + saccharose-stamopløsning. pH 7,15 (juster med KOH) Reagens Koncentration (mM) Kaliumgluconat (Kglu) 140 MgCl2 2 TES 10 ATP magnesiumsalt (MgATP) 4 GTP natriumsalt (Na2 GTP) 0,4 P-nicotinamid adenin-dinukleotidhydrat (NAD) 1 Opbevares ved -20 ° C. Tabel 3: Intracellulær Solution (IS1). Kemisk beskrivelse og de specifikke mængder, der kræves for at producere IS1, som hovedsagelig anvendes til intensitetsrespons og kvantumbumpmålinger. pH 7,15 (juster med CsOH) Reagens Koncentration (mM) CsCI 120 MgCl2 2 TES 10 ATP magnesiumsalt (MgATP) 4 GTP natriumsalt (Na2 GTP) 0,4 P-nicotinamid adenin-dinukleotidhydrat (NAD) 1 Tetraethylammoniumchlorid (TAE) 15 Opbevares ved -20 ° C. Tabel 4: Intracellulær Opløsning (IS2). Kemisk beskrivelse og de specifikke mængder, der kræves for at producere intracellulær opløsning IS2, som hovedsagelig anvendes til reversering potentielle målinger af den lysinducerede strøm.

Discussion

Anvendelsen af ​​helcelleoptagelser til D. melanogasterfotoreceptorer tilladt til opdagelsen og funktionel belysning af nye signalproteiner, såsom TRP-kanaler 27 , 28 , 29 og INAD 30 , 31 , 32 stilladsprotein. Lige siden den indledende introduktion af denne teknik gjorde det muligt at løse langsigtede grundlæggende spørgsmål vedrørende den ioniske mekanisme og spændingsafhængigheden af ​​lysresponsen. Dette skete på grund af den tildelte evne til nøjagtigt at kontrollere membranspændingen og den ekstracellulære og intracellulære ioniske sammensætning 19 , 28 .

En stor hindring for patch-klemmeteknikken i D. melanogaster har været skrøbelighed hos den isolerede ommatidia preparationere. Detaljerede undersøgelser har afsløret, at fototransduktionsmaskineriets integritet er kritisk afhængig af den kontinuerlige forsyning af ATP, især under lyseksponering, hvilket fører til et stort forbrug af ATP. Desværre eliminerer den mekaniske stripning af pigmentet ( dvs. glia) cellerne, som er nødvendig for at nå fotoreceptormembranen med patchpipetten, den vigtigste kilde til metabolitter, der er nødvendige for ATP-produktion 33 . Anvendelse af exogen ATP i registreringspipetten opfylder kun delvis kravet om store mængder ATP. En kort forsyning af ATP fører til spontan aktivering af TRP-kanalerne og dissociationen af ​​fototransduktionsmaskineriet fra de lysaktiverede kanaler, hvilket forårsager en stor forøgelse af cellulær Ca 2+ og afskaffelsen af ​​det normale respons på lys 34 , 35 . Denne rækkefølge af begivenheder skyldes ikke skade påFotoreceptorer ved dissektionsproceduren, men snarere til den cellulære udtømning af ATP. For at forhindre denne forekomst af hændelser og for at opretholde normale lysresponser, bør fotoreceptorerne ikke udsættes for intense lys, der forbruger store mængder ATP. NAD skal også inkluderes i registreringspipetten, formodentlig at lette ATP-produktion i mitokondrierne 18 , 36 . Til måling af spontane og kvantumstød er ovennævnte sværhedsgrad minimal, fordi der kun anvendes dimlampe. I praksis kan en stabil helcelleoptagelse opretholdes i ~ 20-25 minutter, selvom der er en tendens til, at reaktionskinetikken sænker over denne periode. Et enkelt præparat af dissocieret ommatidia kan forblive levedygtig i op til 2 timer.

En yderligere mangel på det isolerede ommatidia-præparat er utilgængeligheden af ​​microvilli, som oversætter utilgængeligheden af ​​TRP ogTRPL kanaler til optagelsespipetten, hvilket forhindrer enkeltkanaloptagelser. Ved hjælp af en metode, de udviklede, lykkedes Bacigalupo og kolleger at optage enkanalaktivitet direkte fra rhabdomere 37 . Denne kanalaktivitet adskiller imidlertid sig fra den af ​​TRPL-kanaler, der heterologt udtrykkes i vævskulturceller 38, og fra TRP-kanalaktivitet afledt af skudstøjanalyse opnået fra isoleret ommatidia 34 . Formentlig beskadigede dissektionsproceduren fotoreceptorcellerne væsentligt ved anvendelse af denne metode.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Den eksperimentelle del af denne forskning blev støttet af tilskud fra den amerikanske og israelske Bi National Science Foundation (til BM og IL), Israels videnskabsstiftelse (ISF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (til BM) og bioteknologien Og Biologisk Forskningsråd (BBSRC Grant-nummer: BB / M007006 / 1 og BB / D007585 / 1) til RCH

Materials

10 ml syringe
5 ml syringe
1 ml syringe with elongated tip
Petri dish 60 mm
Silicone dissection dish/block Dow Corning Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter 
Capillaries (for omatidia separation) Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)
Polyethylene Tubing Becton Dickinson 1.57 x 1.14 mm (35 cm)
 2 small beakers 50 ml or less
2 paraffin film sheets Parafilm M ~5 x 5 cm
Bath chamber home made
Cover slips 22 x 22 mm No. 0
Paraplast Plus Sigma Paraffin – polyisobutylene mixture To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber
Ground Warner Instruments  64-1288 Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly
Headless micro dissection needle Entomology, 12 mm
Micro dissecting needle holder
Vise
2 fine tweezers + 1 rough tweezers Dumont #5, Biology  0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox
Stereoscopic zoom Microscope  Nikon SMZ-2B
Cold light source Schott KL1500 LCD
Filter (Color) for cold light source Schott RG620
Delicate wipers Kimtech Kimwipes
Electrode holder Warner Instruments QSW-T10P Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style
Silver Wire Warner Instruments 0.25 mm diameter, needs to be chloridized
Micromanipulator Sutter Instruments MP 85 Huxley-Wall Style Micromanipulator
Faraday cage home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01
Osilloscope GW GOS-622G
Perfusion system Warner Instruments VC-8P Pinch valve control system
Perfusion valve controller Scientific instruments BPS-8
Suction system
Amplifier Molecular Device Axopatch-1D
Head-stage Molecular Device CV – 4 Gain: x 1/100
A/D converter Molecular Device Digidata 1440A
Clampex Molecular Device 10 software
pCLAMP Molecular Device 10 software
Light source (Xenon Arc lamp) Sutter Instruments Lambda LS
Light detector home made phototransistor
Filter wheel and shutter controller Sutter Instruments Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter
Filters (Natural density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElecftronic JML-C2
Light guide Quartz 
Pulse generator AMPI Master 8
Microscope Olympus IX71, Inverted
Red illumination filter (Microscope) RG630 / RG645 ø45mm
Microscope objective Olympus X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil
CCD Camera Andor iXon DU885K
NIS Element  Nikon AR software
Ca+2 indicator Invitrogen Calcium green 5N
Excitation & emission filters and dichroic mirror Chroma 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set
Vertical pipette puller Narishige  Model PP83 Use either vertical or horizontal puller, as preferred.
Horizontal pipette puller Sutter Instrument  Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller
Filament Sutter Instrument 3 mm trough or square box
Capillaries Harvard Apparatus borosilicate glass capillaries 1 x 0.58 mm

Referenzen

  1. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).
  2. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  3. Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).
  4. Weiss, S., et al. Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration. J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).
  5. Wang, T., et al. Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX. Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).
  6. Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation. J. Physiol. Lond. 440, (1991).
  7. Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).
  8. Nasi, E. Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra. J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).
  9. Nasi, E., Gomez, M. P. Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians. J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).
  10. Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).
  11. Kohn, E., et al. Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo. J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).
  12. Hevers, W., Hardie, R. C. Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors. Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).
  13. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  14. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).
  15. Scott, K., Zuker, C. S. Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses. Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).
  16. Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors. J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).
  17. Katz, B., Minke, B. Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors. J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).
  18. Hardie, R. C., et al. Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase. Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).
  19. Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL. Neuron. 19, 1249-1259 (1997).
  20. Liu, C. H., et al. In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel. J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).
  21. Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O’Tousa, J. E. Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).
  22. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  23. Liu, C. H., et al. Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III. Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).
  24. Cook, B., et al. Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo. Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).
  25. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  26. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).
  27. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).
  28. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  29. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  30. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  31. Shieh, B. H., Niemeyer, B. A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila. Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).
  32. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  33. Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina. J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).
  34. Hardie, R. C., Minke, B. Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).
  35. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  36. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
  37. Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
  38. Parnas, M., Katz, B., Minke, B. Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel. J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).
check_url/de/55627?article_type=t

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (124), e55627, doi:10.3791/55627 (2017).

View Video