Helecelleoptagelser fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer muliggør måling af spontane mørke humper, kvantebumps, makroskopiske responser til lys og aktuelle spændingsforhold under forskellige forhold. I kombination med D. melanogaster genetiske manipulationsværktøjer muliggør denne metode undersøgelsen af den allestedsnærværende inositol-lipid-signalvej og dens mål, TRP-kanalen.
Hele celle spænding clamp optagelser fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer har revolutioneret området for invertebrat visuel transduktion, hvilket muliggør brugen af D. melanogaster molekylær genetik til at studere inositol-lipid signalering og transient receptor receptor potentielle (TRP) kanaler på single-molekylen niveau. En håndfuld laboratorier har mestret denne kraftfulde teknik, som gør det muligt at analysere de fysiologiske reaktioner på lys under højt kontrollerede forhold. Denne teknik tillader kontrol over det intracellulære og ekstracellulære medium; Membranspændingen; Og hurtig anvendelse af farmakologiske forbindelser, såsom en række ioniske eller pH-indikatorer, til intra- og ekstracellulære medier. Med et usædvanligt højt signal-til-støjforhold gør denne metode det muligt at måle mørke spontane og lysinducerede enhedsstrømme ( dvs. spontane og quantum humle) og makroskopiske lysinducerede strømme (LIC) fra syndGle D. melanogaster fotoreceptorer. Denne protokol beskriver detaljeret alle de vigtigste trin, der er nødvendige for at udføre denne teknik, som omfatter både elektrofysiologiske og optiske optagelser. Flyvehindehindefordelingsproceduren til opnåelse af intakt og levedygtig ex vivo- isoleret ommatidia i badekammeret er beskrevet. Det udstyr, der er nødvendigt for at udføre helcelle- og fluorescensbilledmålinger, er også detaljerede. Endelig forklares faldgruberne ved brug af dette delikate præparat under udvidede eksperimenter.
Omfattende genetiske undersøgelser af frugtflyve , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , der blev indledt for mere end 100 år siden, har etableret D. melanogaster- flyve som en yderst nyttig eksperimentel model til genetisk dissektion af komplekse biologiske processer. Den nedenfor beskrevne metode kombinerer den akkumulerede effekt af D. melanogaster molekylær genetik med det høje signal-til-støjforhold for fuldcelle patch clamp-optagelser. Denne kombination muliggør undersøgelsen af D. melanogaster- fototransduktion som en model for inositol-lipid-signalering og TRP-kanalregulering og -aktivering både i det oprindelige miljø og ved den højeste opløsning af enkeltmolekyler.
Anvendelse af helcelleoptagelsesmetoden til D. melanogaster fotoreceptorer har revolutioneret undersøgelsen af invertebratfototransduktion. Denne metode blev udviklet af Hardie 1 og indepEndelig af Ranganathan og kolleger for 2 ~ 26 år siden og var designet til at udnytte de omfattende genetiske manipulationsværktøjer af D. melanogaster og bruge dem til at afdække mekanismer for fototransduktion og inositol-lipid signalering. I starten led denne teknik af en hurtig reduktion i lysfølsomhed og et lavt udbytte af ommatidier under dissektionsprocessen, hvilket forhindrede detaljerede kvantitative undersøgelser. Senere øgede tilsætningen af ATP og NAD til patchpipetten dramatisk hæftelsen af præparatet til længerevarende kvantitative optagelser. Derefter blev omfattende karakterisering af signaltransduktionsmekanismen på molekylniveau realiseret.
I øjeblikket er D. melanogaster- fototransduktion et af de få systemer, hvor phosphoinositidsignalerings- og TRP-kanaler kan studeres ex vivo ved enkeltmolekylopløsning. Dette gør D. melanogaster fototransduktion og migThodology udviklet til at studere denne mekanisme et meget følsomt modelsystem. Denne protokol beskriver, hvordan man dissekerer D. melanogaster retina og mekanisk striper den isolerede ommatidia fra de omgivende pigment (glia) celler. Dette muliggør dannelsen af en giga-tætning og en helcelle patch klemme på fotoreceptor celle legemer. Heldigvis er de fleste signalproteiner begrænset til rhabdomere og diffunderer ikke. Derudover er der en immobil Ca 2+ buffer kaldet calphotin, der er placeret mellem signalkammeret og cellekroppen 3 , 4 og et højt ekspressionsniveau for Na + / Ca 2+ -veksleren (CalX) i mikrovilli 5 . Sammen giver proteinindeslutning til rhabdomeren, calphotin-bufferen og den høje ekspression af CalX mulighed for relativt langvarig ( dvs. op til ~ 20 min) helcelleoptagelser uden tab af væsentlige komponenterAf fototransduktionsprocessen og samtidig opretholde høj følsomhed over for lys. Den følgende protokol beskriver, hvordan man får isoleret ommatidia og udfører helcelleoptagelser, der synes at bevare fototransduktionskaskadens native egenskaber. Hele-celle patch clamp eksperimenter på dissocieret kakerlak ( Periplaneta americana ) 6 og cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia blev udført tilsvarende som beskrevet for D. melanogaster . Desuden blev patch clamp eksperimenter på dissocierede fotoreceptorer af filen clam, ( Lima scabra ) og jakobsmuslinger ( Pecten irradians ) udført på en lidt anden måde end den, der blev udført på D. melanogaster , hvilket tillader både helcelle 8 og enkeltkanal målinger 9 . Her beskrives de vigtigste resultater opnået i D. melanogaster under anvendelse af denne teknik. Diskussionen iHerunder beskrivelse af nogle faldgruber og begrænsninger af denne teknik.
Anvendelsen af helcelleoptagelser til D. melanogasterfotoreceptorer tilladt til opdagelsen og funktionel belysning af nye signalproteiner, såsom TRP-kanaler 27 , 28 , 29 og INAD 30 , 31 , 32 stilladsprotein. Lige siden den indledende introduktion af denne teknik gjorde det muligt at løse langsigtede grundlæggende spørgsmål vedrørende den ioniske mekanisme og spændingsafhængigheden af lysresponsen. Dette skete på grund af den tildelte evne til nøjagtigt at kontrollere membranspændingen og den ekstracellulære og intracellulære ioniske sammensætning 19 , 28 .
En stor hindring for patch-klemmeteknikken i D. melanogaster har været skrøbelighed hos den isolerede ommatidia preparationere. Detaljerede undersøgelser har afsløret, at fototransduktionsmaskineriets integritet er kritisk afhængig af den kontinuerlige forsyning af ATP, især under lyseksponering, hvilket fører til et stort forbrug af ATP. Desværre eliminerer den mekaniske stripning af pigmentet ( dvs. glia) cellerne, som er nødvendig for at nå fotoreceptormembranen med patchpipetten, den vigtigste kilde til metabolitter, der er nødvendige for ATP-produktion 33 . Anvendelse af exogen ATP i registreringspipetten opfylder kun delvis kravet om store mængder ATP. En kort forsyning af ATP fører til spontan aktivering af TRP-kanalerne og dissociationen af fototransduktionsmaskineriet fra de lysaktiverede kanaler, hvilket forårsager en stor forøgelse af cellulær Ca 2+ og afskaffelsen af det normale respons på lys 34 , 35 . Denne rækkefølge af begivenheder skyldes ikke skade påFotoreceptorer ved dissektionsproceduren, men snarere til den cellulære udtømning af ATP. For at forhindre denne forekomst af hændelser og for at opretholde normale lysresponser, bør fotoreceptorerne ikke udsættes for intense lys, der forbruger store mængder ATP. NAD skal også inkluderes i registreringspipetten, formodentlig at lette ATP-produktion i mitokondrierne 18 , 36 . Til måling af spontane og kvantumstød er ovennævnte sværhedsgrad minimal, fordi der kun anvendes dimlampe. I praksis kan en stabil helcelleoptagelse opretholdes i ~ 20-25 minutter, selvom der er en tendens til, at reaktionskinetikken sænker over denne periode. Et enkelt præparat af dissocieret ommatidia kan forblive levedygtig i op til 2 timer.
En yderligere mangel på det isolerede ommatidia-præparat er utilgængeligheden af microvilli, som oversætter utilgængeligheden af TRP ogTRPL kanaler til optagelsespipetten, hvilket forhindrer enkeltkanaloptagelser. Ved hjælp af en metode, de udviklede, lykkedes Bacigalupo og kolleger at optage enkanalaktivitet direkte fra rhabdomere 37 . Denne kanalaktivitet adskiller imidlertid sig fra den af TRPL-kanaler, der heterologt udtrykkes i vævskulturceller 38, og fra TRP-kanalaktivitet afledt af skudstøjanalyse opnået fra isoleret ommatidia 34 . Formentlig beskadigede dissektionsproceduren fotoreceptorcellerne væsentligt ved anvendelse af denne metode.
The authors have nothing to disclose.
Den eksperimentelle del af denne forskning blev støttet af tilskud fra den amerikanske og israelske Bi National Science Foundation (til BM og IL), Israels videnskabsstiftelse (ISF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (til BM) og bioteknologien Og Biologisk Forskningsråd (BBSRC Grant-nummer: BB / M007006 / 1 og BB / D007585 / 1) til RCH
10 ml syringe | |||
5 ml syringe | |||
1 ml syringe with elongated tip | |||
Petri dish | 60 mm | ||
Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
2 small beakers | 50 ml or less | ||
2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
Bath chamber | home made | ||
Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
Micro dissecting needle holder | |||
Vise | |||
2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
Osilloscope | GW | GOS-622G | |
Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
Suction system | |||
Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
Clampex | Molecular Device | 10 | software |
pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
Light detector | home made | phototransistor | |
Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
Light guide | Quartz | ||
Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
NIS Element | Nikon | AR | software |
Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |