השיטה המתוארת אפשרה את ההקלטה המדויקת של הזרמים האוניברסליים הבסיסיים המייצרים בליטות קוונטיות ספונטניות וקלות, אשר מסכמות את התגובה המאקרוסקופית לאור, בתנאים מוגדרים. היא גם אפשרה השוואה בין זבובים wildtype ו מוטציה כי יש פגמים במולקולות איתות קריטי ( תרשימים 3 ו – 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . בנוסף, היכולת למדוד פוטנציאל היפוך בתנאים דו-יוניים גילתה מאפיינים ביו-פיסיקליים בסיסיים של TRP ו- TRP (ערוצים) 18 , 19 . זה גם איפשר את המדידה של ההשפעות של חומצות אמינו תחליפים באזור הנקבוביות של TRP כי שונה Ca 2 + שלהחדירות 20 . התגובה האור המתקבל על ידי תיקון מהדק כל תא הקלטות תלוי ליניארי על עוצמת האור לפחות 4 סדרי גודל. זה לא יכול להיפתר באמצעות ERG ושיטות הקלטה תאיים. לפיכך, סדרה של תגובות על הבזקים קצרים של העוצמה הגוברת ומזימה של פונקציית התגובה האינטנסיבית חשפה ליניאריות קפדנית של תגובת הפלאש עם עוצמת האור הגוברת. הליניאריות הקפדנית מחזיקה עד לפחות כמה מאות pA, אך ניתן להתווכח אם לאחר מכן היא ליניארית או שליטה מהדק כי נשבר ( איור 6 ). תוצאות אלו מצביעות על כך שהתגובות המאקרוסקופיות לאור הן סיכום ליניארי של התגובות היחידות לאור ( כלומר, בליטות קוונטיות). היא כבר מבוססת היטב באמצעות הקלטות מתח כי אור עמום גירוי indUces תנודות מתח בדידים ( כלומר, הקוונטים bumps) ברוב המינים חסרי חוליות. D מלנוגאסטר הקוונטים bumps תוצאה של פתיחת מושרשת של ~ 15 ערוצים TRP ו ~ 2 TRPL ערוצי בשיא של גבשושית 18 . כל בליטה נוצרת על ידי ספיגתו של פוטון בודד, ואילו התגובה המקרוסקופית לאורות אינטנסיביים יותר היא סיכום של תגובות אלה היסודי 14 , 21 . הבליטות משתנות באופן משמעותי בזמן חביון, זמן ומשרעת, גם כאשר תנאי הגירוי זהים. דור הבליטה הוא תהליך סטוכסטי המתואר על ידי הסטטיסטיקה פואסון, לפיה כל פוטון נספג ביעילות מעורר רק מכה אחת. מערכת הפוטון החד-פעמית דורשת שכל צעד במפל כולל לא רק מנגנון "הפעלה עצמית" יעיל, אלא גם מנגנון "כיבוי" יעיל באותה מידה. היתרון הפונקציונאלי הוא ייצור שלמאוד פוטון רגיש עם תגובה מהירה חולף מתאים מאוד הן את הרגישות ואת הפתרון הזמני הנדרש על ידי מערכת חזותית. הדרישה למנגנון כיבוי יעיל מתגלה כאשר הפוטופיגמנט הפעיל ( כלומר metarhodopsin, M) או היעד שלו, ה- q α α, אינו מצליח להשבית ומוביל לייצור רציף של בליטות זמן רב לאחר כיבוי האור ( איור). 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . הבליטה מייצגת את הפעילות השיתופית של ערוצי TRP / TRPL ב microvillus. ככזה, כל השערה של הפעלת ערוץ צריך גם להסביר הפעלה ערוץ שיתופית. לאחרונה, הרדי ועמיתיו הוכיחו כי האור מעורר התכווצויות מהירות של photoreceptors, מה שמרמז כי אור רגיש(TRP / TRPL) ניתן לנשל באופן מכני 25 . פעולה מכנית זו, יחד עם הפרוטונים שנצפו על ידי PLC- בתיווך PIP 2 הידרוליזה, לקדם את הפתיחה של ערוצי TRP / TRPL ולהסביר את האופי השיתופי של ייצור בליטה 26 . נכון לעכשיו, dore melanogaster photoreceptors הם אחד המעטים המערכות שבהן איתות phosphoinositide ו TRP ערוצים ניתן ללמוד in vivo , ובכך הפיכת dot melanogaster phototransduction ואת המתודולוגיה פיתחה ללמוד מנגנון זה מערכת מודל יקר מאוד. איור 3: inaC P209 ו inaD P215 מוטנטים לחשוף תגובה איטית סיום של תגובה מאקרוסקופית לאור של הבטן הקוונטית יחיד. ( א ) מבודד ommatidium prepaRation עם פיפטה תיקון מלא פלואורסצנטי לוציפר צבע צהוב CH (עירור: 430 ננומטר, פליטה: 540 ננומטר) מוצג במהלך הקלטה בתא שלם. שים לב כי צבע פלואורסצנטי diffused ו שכותרתו תא תא יחיד photoreceptor וכי גופי התא photoreceptor מנותקים מן האקסונים המוארכים שלהם, אך עדיין לשמור על הכדאיות. הכנה זו מתאימה להקלטות תא שלם בו זמנית וניסויי הדמיה. ( BD ) לוחות עליון: מתח של תא שלם הידק התגובות הקוונטית מכה הקפדה על אור עמום רציף (בר פתוח) ב WT, inaC P209 , ו inaD P215 זבובים מוטציה. סיומת איטית של בליטות נצפתה inaC P209 ו inaD P215 מוטציות יחסית זבובים WT. הבלעה להלן מציגה את הצורה המוגדלת של בליטות בודדות. פאנלים תחתונים: תגובות מנורמליות של כל התא שנרשמו בתא מקרוסקופי לדופק אור של 500 מילי-סיביות (1.5 x 10 5 פוטונים לכל ים) של wildtype לעיל זבובים מוטנטים. (EG) פאנלים עליונים: מתח של תא שלם הידק התגובות קוונטית הקצבום קצר (1 MS), אור עמום מעוררים תגובות פוטון יחיד wildtype, arr2 3 , ו זנבות מוטציה ninaC P235 . הערה הרכבת של הבליטות שנצפו arr2 3 ו ניאנק P235 זבובים מוטציה בתגובה ספיגת פוטון בודד. פאנלים תחתונים: מתח של תא שלם הדביק תגובות מנורמל לדופק אור 500 מילישניות (1.5 x 10 4 פוטונים / ים) במוטנטים המתאימים. שים לב לסיום האיטי של התגובות המאקרוסקופיות שנצפו ב- arr2 3 ו ניאנק P235 זבובים מוטציה יחסית WT. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. D / 55627 / 55627fig4.jpg "/> איור 4: נייד Ca 2 + Dynamics בעקבות איתות המושרה Ca 2 + זרם מושפע על ידי Calphotin. סדרת זמן של תמונות photoreceptor של wildtype ו Cpn 1% זבובים מראה את הקרינה של מחוון Ca 2 + במהלך גירוי האור. תמונות בעוצמה גולמית הם זממו באמצעות שקר צבע קידוד (בר = 10 מיקרומטר, ראשי חצים מצביעים על פיפטה). איור הודפס באישור של Weiss et al. 4 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5: המאפיינים האלקטרוניים של WT, trp, ו trpl מוטציות. ( A ) מתח מלא מתח clo recoRdings של קוונטי bumps בתגובה אור עמום רציף (בר פתוח) ב WT, trpl 302 , ו trp P343 זבובים מוטנטים null. אמפליטודות מופחתות מאוד של trp P34 3 bumps הם נצפו. הבלעה: הגדלת בליטות קוונטיות יחיד של wildtype ו trp P343 זבובים מוטנטים n מוצגים. ( ב ) מתח תא מלא clamp הקלטות בתגובה לדופק אור 3 של wildtype ואת מוטציות המתאימים. התגובה הארעית של מצב קבוע של מוטציה P343 trp נצפתה. הבלעה: תגובות אור מוגדל של WT ו trp P343 מוטציה מוצגים. ( ג ) משפחה של זרמים אור המושרה האור של זנים לעיל זבוב, לעורר בתגובה לדופק אור 20 ms, על צעדים מתח של 3 mV, נמדד סביב פוטנציאל היפוך (E rev ). ( ד ) היסטוגרמה המתווימה את הרושם הממוצע של wildtype ואת המוטאנים השוניםTs. ברים שגיאה הם SEM פוטנציאל ההיפוך (E rev ) של WT הוא בין rev חיובי E של trpl 302 , אשר מבטא רק TRP, ואת E rev של טרפ P343 מוטציה trp , המבטא רק TRPL. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 6: תגובה Flash היא ליניארית עם הגדלת עוצמת האור. סדרה של תגובות עכשוויות על הבזקים קצרים של עוצמת האור הגוברת ומזימה של התלות של משרעת שיא התגובה האור על העוצמה הגוברת של הבזקים אור קצר. מערכת יחסים זו חושפת ליניאריות קפדנית בין תגובת הפלאש לבין עוצמת האור הגוברת. ליניאריות קפדנית זומחזיק עד לפחות כמה מאות PAA, עם עוצמת אור פורש מעל 4 סדרי גודל, בעוד הוא שנוי במחלוקת אם זה ליניאריות או שליטה מהדק כי נשבר לאחר מכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. PH 7.15 (להתאים עם NaOH) מֵגִיב ריכוז (mM) NaCl 120 KCl 5 MgCl 2 4 TES 10 פרולין 25 אלנין 5 חנות ב -20 מעלות צלזיוס. <td colspan= "2"> הערה: פתרון זה הוא nomineally Ca 2 + חינם אבל אין Ca 2 + מאגרים הוסיף ולכן יהיה בערך 5-10 מיקרומטר זכר Ca 2 + . פתרון תאיים (ES) = ES-0Ca 2 + עם 1.5 מ"מ CaCl 2 , שנעשו על ידי הוספת CaCl 2 מ 0.5 או 1 M פתרון המניה ES-0Ca 2 + . טבלה 1: Ca +2 – פתרון תאיים חינם (ES). תיאור כימי ואת הכמויות הספציפיות הנדרשות כדי לייצר Ca +2 ללא תשלום ES. מֵגִיב כמות FBS 15 מ"ל סוכרוז 1.5 גרם מחלקים אל 150 aliquots μL ב 1.5 מ"ל בקבוקונים לאחסן ב -20 76; C. פתרון Trituration (TS) מילוי 1 בקבוקון של 150 מ"ל של פתרון המניות עם 1,350 מ"ל ES או ES-0Ca 2 + , כדי להתאים את הפתרון המשמש במהלך לנתיחה. טבלה 2: סרום שור עוברית (FBS) + Sucrose – פתרון המניה. תיאור כימי ואת כמויות ספציפיות נדרש לייצר בסרום שור העובר (FBS) + סוכרוז – פתרון המניה. PH 7.15 (כוונן עם KOH) מֵגִיב ריכוז (mM) אשלגן gluconate (Kglu) 140 MgCl 2 2 TES 10 מלח מגנזיום ATP (MgATP) 4 מלח נתרן GTP (Na 2 GTP) 0.4 Β-Nicotinamide adenine דינוקליוטיד הידרט (NAD) 1 חנות ב -20 מעלות צלזיוס. טבלה 3: פתרון תאיים (IS1). תיאור כימי ואת הכמויות הספציפיות הדרושות לייצור IS1, המשמש בעיקר לתגובה בעוצמה ומדידות הקוונטים. PH 7.15 (התאם עם CsOH) מֵגִיב ריכוז (mM) CsCl 120 MgCl 2 2 TES 10 מלח מגנזיום ATP (MgATP) 4 מלח נתרן GTP (Na 2 GTP) 0.4 Β-Nicotinamide adenine דינוקליוטיד הידרט (NAD) 1 טטרה-אתיל-אמוניום כלורי (TAE) 15 חנות ב -20 מעלות צלזיוס. טבלה 4: פתרון תאיים (IS2). תיאור כימי ואת הכמויות הספציפיות הנדרשות כדי לייצר פתרון תאיים IS2, אשר משמש בעיקר עבור המדידות פוטנציאל היפוך של האור המושרה הנוכחי.