Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

WSR stammt aus der Blastozyste inneren Zellmasse. Diese Zellen sind pluripotent, dh sie haben die Fähigkeit zur Differenzierung zu jedem Zelltyp des Ursprungsorganismus haben. ESC in vitro Differenzierung von breitem Interesse als experimentelles System für die Entwicklungsweg und Mechanismen zu untersuchen. Es bietet ein starkes und flexibles Modellsystem neue therapeutische Ansätze zur Korrektur von Zell- und Gewebestörungen zu testen. EBs rekapitulieren viele Aspekte der Zelldifferenzierung während der frühen Embryonalentwicklung. Insbesondere kann EBs verwendet werden , wenn embryonale Letalität erschwert es , die zellulären Grundlagen der embryonalen Defekte ^{1, 2} zu bestimmen. EBs können ³ durch den hängenden Tropfen oder flüssigen Suspensionstechniken gebildet entweder werden. Der Vorteil des ersteren ist die Fähigkeit, EBs konsistenter Größe und Dichte zu erzeugen, so dass experimentelle Reproduzierbarkeit zu erleichtern.

<p class = "„jove_content“"> Wechselwirkungen mit extrazellulären Matrix (ECM) Adhäsionsproteine ​​kann die Beweglichkeit und das Überleben von adhärenten Zellen beeinflussen. In dem 2D-Kultursystem wird oft Fibronektin zu erhöhen Zelladhäsion auf das Substrat aufgebracht. Fibronectin ist eine Basallamina Komponente um 10 Arten von Zelloberflächen – Integrin – Heterodimeren erkannt ^4.

RA ist ein kleines lipophiles Metabolit von Vitamin A , das ⁵ neurale Differenzierung ^{induziert, 6.} Hohe Konzentrationen von RA Förderung neuronaler Genexpression reprimiert und mesodermalen Genexpression während der EB Bildung ^{7, 8.} RA wird durch Vitamin – A – Oxidation Retinaldehyd entweder durch Alkohol oder Retinol – Dehydrogenase, gefolgt von Retinaldehyd Oxidation zum Endprodukt durch Retinaldehyd dehydrogenase ⁹ hergestellt. Neuronale Differenzierung erfordert Transport von RA aus dem Cytoplasma an den Kern durch zelluläre RA-bindendes Protein 2 (CRABP2). Im Kern bindet RA an seinen zugehörigen Rezeptor – Komplex , bestehend aus einem RAR-RXR – Heterodimer ^10. Dies führt bei der Rekrutierung von Transkriptions Co-Aktivator, und der Initiation der Transkription ^{9, 11.} Darüber hinaus fördert die RA den Abbau von phosphoryliertem (aktiv) SMAD1, wodurch BMP und SMAD Antagonisierung ¹² signalisiert. Zusätzlich zu diesen Aktivitäten erhöht RA Pax6 – Expression, einen Transkriptionsfaktor, ¹³ neuralen Differenzierung unterstützt. RA – Signalisierung moduliert durch sirtuin-1 (Sirt1), ein Kern Nicotinamidadenindinucleotid (NAD +) – abhängiges Enzym , die CRABP2 deacetyliert, mit seiner Translokation in den Zellkern zu stören, und damit mit RA der Bindung an den RAR-RXR – Heterodimer ^{14, 15, 16.}

e_content "> Unser Ziel der RA-behandelten EB – Protokoll bei der Gestaltung hier beschriebene neuronale Differenzierung zu optimieren , um in – vitro – Analyse der Signalwege zu erleichtern , die ESC Differenzierung in Zellen neuronalen Vorläufer regulieren. Einer der Vorteile dieses Protokolls ist die Erleichterung der die Analyse der Zellfunktion durch Immunofluoreszenz. 3D EBs ist gut nicht durch Antikörper durchdrungen und ist schwer zu Bild. EB Dissoziation in einen 2D-Monolayer zu bestimmten Zeitpunkt während der neuronalen Differenzierung und Immunomarkierung Bildgebung der Zellen durch konfokale Mikroskopie ermöglicht.