تقنية المناظير لجمع المسلسل من الكبد والغدد الليمفاوية مساريقي في قرود المكاك
Summary
هنا، نحن تصف تقنية المناظير كسبها لأخذ العينات المسلسل من الكبد والغدد الليمفاوية المساريقي (MLN) في قرود المكاك التي تسمح لزيادة تواتر أخذ العينات، ويقلل من احتمالات المضاعفات الجراحية عند مقارنة أداء البطن.
Abstract
ويتعرض العقد الليمفاوية المساريقي (MLN) والكبد للميكروبات والمنتجات الميكروبية من (GI) الجهاز الهضمي، مما يجعلها فريدة من نوعها مناعيا. الجهاز الهضمي وMLN المرتبطة ومواقع تكاثر الفيروس في وقت مبكر من العدوى البشرية بفيروس نقص المناعة (HIV) وMLN من المرجح المواقع خزان الهامة التي تأوي الخلايا المصابة خفية حتى بعد العلاج المضاد للفيروسات لفترات طويلة (ART). وقد تبين الكبد للعب دورا هاما في الاستجابات المناعية لlentiviruses ويبدو أن تلعب دورا هاما في إزالة الفيروس من التداول. الرئيسيات غير البشرية (NHP) نماذج لفيروس نقص المناعة البشرية ومتلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) تحاكي عن كثب هذه الجوانب من عدوى فيروس نقص المناعة البشرية وأخذ عينات طولية المسلسل من المواقع الرئيسية لتكاثر الفيروس والاستجابات المناعية المرتبطة في هذا النموذج سوف تساعد على توضيح الأحداث الهامة في الإصابة، المرضية ، وتأثير استراتيجيات التدخل المختلفة على هذه الأحداث. داءتقنيات والأنف والحنجرة نشرت لأخذ عينات الكبد وMLN يشتملان عملية جراحية كبرى و / أو التشريح، مما يحد من القدرة على التحقيق في هذه المواقع الهامة بطريقة التسلسلي في نفس الحيوان. وصفناها سابقا تقنية المناظير لجمع مليون. هنا، نحن تصف تقنية المناظير كسبها لأخذ العينات طولية المسلسل من الكبد وMLN خلال نفس موقعين ميناء المطلوبة لجمع مليون. استخدام نفس الميناءين يقلل من تأثير على الحيوانات التي يتطلبها أي شقوق إضافية. هذه التقنية يمكن استخدامها مع زيادة تردد أخذ العينات مقارنة عملية جراحية في البطن الكبرى، ويقلل من احتمالات المضاعفات الجراحية وما يرتبط بها من الاستجابات الالتهابية المحلية والنظامية التي يمكن أن تعقد تفسير النتائج. هذا الإجراء لديها امكانات لتسهيل دراسة شملت نماذج NHP مع تحسين رعاية الحيوان.
Introduction
الجهاز الهضمي (GI) هو أكبر سطح الغشاء المخاطي في الجسم ويتعرض لعدد لا يحصى من المستضدات المستمدة من الغذاء ومسببات الأمراض، والمجتمعات البكتيرية endosymbiotic يشار إلى أن microbiome 1 و 2. الغدد الليمفاوية المساريقي (MLN) خط الجهاز الهضمي وهي الموقع الرئيسي لوظائف المناعة لتعزيز الاستجابات الالتهابية أو مولد للتحمل نحو هذه المستضدات المختلفة. المنظمة المادية للMLN يخلق نظاما مجزأة يمكن أن تستجيب لمستضدات محليا دون استثارة ردود النظامية 3. وبالمثل، الدم من المصارف الجهاز الهضمي إلى الكبد عن طريق الوريد البابي قبل أن يعود إلى التداول، وبالتالي يتعرض للميكروبات والمنتجات الميكروبية التي translocated من الجهاز الهضمي في الصفيحة المخصوصة ودخلت مجرى الدم 4. وظائف الكبد أيضا بمثابة الثانوي اللمفاوية الجهاز لالثانية لديها عدد كبير من الخلايا المناعية، بما في ذلك الضامة المتخصصة، لإزالة الميكروبات translocated 5، 6. وهكذا، فإن MLN والكبد هي أجهزة المناعة الأولية تتعرض لالمتعايشة والبكتيريا المسببة للأمراض من الجهاز الهضمي، وكذلك الوسط المستضدات من مصادر أخرى، مما يجعلها فريدة من نوعها ومهمة من وجهة نظر المناعية.
وMLN هي المواقع الحرجة لتقييم الآثار عن الفيروسات والمناعية لفيروس نقص المناعة البشري (HIV) أو العدوى المسببة للأمراض نقص المناعة القردي فيروس (SIV)، ويشارك على الأرجح في نشر في وقت مبكر من SIV التالية التحدي داخل المستقيم. ومن المعروف الأنسجة اللمفاوية المرتبطة القناة الهضمية لتكون موقعا رئيسيا للتكرار المستمر فيروس نقص المناعة البشرية، على الرغم من سيطرة فعالة ديه فيروسية دم من العلاجات المضادة للفيروسات الحديثة (ART) 7. في نماذج عدوى فيروس (SIV) وقد ثبت MLN أن تكون الخزانات الهامة من الفيروس كامنا ويجوزيكون الخزان الرئيسي 8 و 9. الكبد هو أيضا مهم في الإصابة lentiviral كما يتضح من تراكم SIV خلايا معينة CD8 + T في كبد قرود المكاك خلال العدوى الحادة SIV 10. وعلاوة على ذلك، هو الجهاز الرئيسي المسؤول عن إزالة الفيروس من تداول 11.
ترتبط بفيروس نقص المناعة البشرية والتهاب SIV مع الجراثيم GI المتغيرة، تعطلت GI سلامة الظهارية، وزيادة النبات الميكروبات والمنتجات الميكروبية من القولون في محيط والدورة 12، 13. وترتبط هذه العمليات مع تنشيط جهاز المناعة المحلية والنظامية، وزيادة معدلات الاعتلال والوفيات في الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية (14). في العدوى SIV، وقد لوحظ البكتيريا translocated في MLN 15، في حين أن تراكم هيئة التصنيع العسكريوقد تبين منتجات robial في الكبد أن يؤدي إلى التهاب وتلف الجهاز 16. وهكذا، في سياق فيروس نقص المناعة البشرية والأمراض للسيف، وMLN والكبد يمكن أن يكون مفيدة للغاية لفهم العمليات الالتهابية يقودها البكتيريا-GI المقيمين.
هنا، نقدم تقنية المناظير كسبها لأخذ العينات المسلسل الى MLN والكبد في الرئيسيات غير البشرية (الرئيسيات). علينا أن نظهر الأداء الناجح لهذه التقنية على اثنين صحية المكاك ريسوس الإناث (RMS)، وأخذ العينات كل حيوان مرتين، مع 160 يوما بين كل عملية جراحية. نذهب لاستخدام هذه العينات لتقييم ومقارنة رئيسيا الكريات البيض والخلايا اللمفاوية السكان داخل كل جهاز باستخدام التدفق الخلوي، وإظهار البيانات متسقة للغاية بين النقاط مرتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، علينا أن نظهر تقنية المناظير لجمع التسلسلي MLN وخزعات الكبد التي كان لها نسبة نجاح 100٪ في هذه وغيرها من الحيوانات وليس وصفها في هذه الدراسة. وعلاوة على ذلك، لم ارتبط استخدام هذه التقنية على الحيوانات نفسها عبر الزمن مع أي أحداث سلبية. في الواقع، لم تكن هناك أي مضاعفات تنتج عن الاعتماد على هذه التقنية في أفواج أخرى من الحيوانات التي كانت مصابة SIV، القردي فيروس / نقص المناعة البشرية (SHIV)، أو فيروس زيكا (بيانات غير منشورة). وبالمثل، فقد أثبتت هذه الجراحة ناجحة حتى في الحيوانات التي خضعت سابقا لعملية جراحية في البطن الكبرى، وفي الحيوانات نقص الصفيحات (بيانات غير منشورة). أثبتنا أن هذه العينات يمكن جمعها من خلال نفس الميناءين عن طريق عكس موقع الكاميرا عند التبديل من MLN إلى الكبد تجنب الحاجة إلى شقوق إضافية. العوامل التي تؤثر على جمع MLN تم الإبلاغ سابقا 13.
<p الطبقة = "jove_content"> ما يصل إلى أربعة مجموعات من 3 MLN و 3 خزعات الكبد كل تم تنفيذها عبر الزمن على الحيوانات الفردية من دون مضاعفات، والتغيرات في معدلات النجاح أو تعديلات على البيانات التي تم جمعها. بالإضافة إلى ذلك، تم الجمع بين هذه التقنية جمع / الكبد بالمنظار MLN بنجاح مع إجراءات أخرى مثل جمع LNS الطرفية، والتنظير العلوي والسفلي الخزعات GI، تطلع نخاع العظام، وجمع السائل النخاعي، وبزل الوريد في نفس الحدث مخدر السماح للتقييم واسع النطاق لل اكتشاف الفيروسات والاستجابات المناعية بطريقة التسلسلي (بيانات غير منشورة).الإجراء بأكمله وعادة ما يستغرق 30 – 45 دقيقة لاستكمال ويتم إنجاز من خلال اثنين من ~ 0.5 سم شقوق. في الحيوانات يعانون من السمنة المفرطة، فإنه قد يكون من الضروري إجراء شق أكبر (~ 1-1،5 سم) لاسترداد MLN من خلال وقد تتطلب وقتا إضافيا لإكمال. الحيوانات مع الدهون المساريقي واسعة غالبا ما تتطلب خبرة كبيرة لدifferentiate MLN من الدهون المحيطة بها. وغالبا ما توجد MLN على طول الأوعية الدموية المساريقي ويبدو أن أكثر انتشارا قرب نقطة فرع في الأوعية. وهناك جانب هام من هذه التقنية هو أنه يتطلب MLN اختيار أن يكون التنقل كاف في مساريق أن exteriorized من خلال شق في البطن. ونتيجة لذلك، فإن هذا الأسلوب لا يمكن أن تستخدم لجمع MLN بالقرب من جذر مساريق. بسبب التكبير، فإنه في بعض الأحيان أسهل لتحديد MLN مع الكاميرا، ويمكن استيعاب في مقربة من MLN مساعدة في تحديد مكان وتحديد العقدة مرة واحدة هو exteriorized ذلك.
قد لا تكون هناك حاجة دائما استخدام موقف تراند لجمع MLN، وإذا كان من الممكن استردادها MLN بسهولة دون استخدام موقف تراند يمكن أن تجعل خزعات الكبد أسهل لأنها سوف تمنع الأعضاء من تحويل cranially. في بعض الأحيان، بعد وضعهم في وضعية ترندلينبورغ، يتم إزاحة الكبد حتى ضد الحجاب الحاجز ويجب يمكن التلاعب بها بلطف العودة الى الموقف قبل جمع الخزعة. كما وضع الميناء لجمع MLN إلى اليسار، وعادة ما تؤخذ الخزعات الكبد من الناحية اليسرى في فصوص الكبد وسطي الجانبية واليسرى لأنها أقرب إلى قنية.
جمعت MLN وخزعات الكبد قدمت غلة وافرة خلية لمجموعة متنوعة من التحليلات التحويلية وأظهرت جدوى عالية من الخلايا التي تم جمعها. هنا، كانت ملطخة الخلايا لتحليل تدفق cytometric من الكريات البيض والخلايا اللمفاوية السكان، وتم توضيح الاختلافات الرئيسية بين هذين الجهازين المناعي الهامة. على سبيل المثال، كانت MLN التخصيب لخلايا CD4 + T مقارنة الكبد، ونظرا لأهمية MLN كنقاط مركزية لجمع ونشر الاستجابات المناعية التكيفية، وكذلك إلى أهمية CD4 + T لإدارة التهابات و ردود مولد للتحمل للبيئة المستضدات المشتقة من المدخول الغذائي والكائنات الدقيقة-GI المقيمينالصورة = "XREF"> 24. ومع ذلك، فقد أثرى الكبد بشكل ملحوظ لCD14 + الكريات البيض بالمقارنة مع MLN. وأعرب عن CD14 الغالب على وحيدات الضامة، وهو عنصر رئيسي في مجمع مستقبلات للlipopolysaccharide في البكتيري (LPS) 25. في الواقع، وترتبط زيادة تركيزات البلازما من CD14 للذوبان مع النبات الجراثيم وتنشيط جهاز المناعة في HIV والأمراض المسببة للأمراض للسيف 26. وهكذا، ترددات أعلى من CD14 + الكريات البيض في الكبد المرجح أن يؤدي من عبء البكتيريا أكبر في هذا الجهاز بالمقارنة مع MLN.
هنا، علينا أن نظهر تقنية جراحية سريعة وبأقل تدخل جراحي لجمع التسلسلي MLN وخزعات الكبد باستخدام اثنين فقط شقوق صغيرة للدخول بالمنظار الذي لم يؤد إلى أي نتائج سلبية. توفر هذه العينات طريقا مفيدا لتقييم العمليات المناعية، فيروسية، والميكروبيولوجية الرئيسية التي تأخذ جيش التحرير الشعبى الصينىم في MLN والكبد، والتي هي منفصلة وفريدة من نوعها من الحصانة النظامية. وبالمثل، خزعات الكبد حاسمة لتقييم المدى الطويل من آثار فيروس نقص المناعة البشرية / SIV، علاجات العقاقير، والميكروبات translocated، والتي غالبا ما تتجمع للحث على تلف الكبد كبير 16. وعلاوة على ذلك، لأن MLN والكبد وأجهزة المناعة يتعرضون لGI الجراثيم، والقدرة على تقييم الحصانة في هذه الأجهزة عبر الزمان يوفر منصة ممتازة لفهم الدور الذي microbiome يلعب في الحفاظ على التوازن المضيف المناعي. مجتمعة، وتقييم الكبد وMLN له أهمية كبرى في سياق اللقاح وefficacies العلاجية، SIV إزالة الخزان الفيروسي، والحصانة المخاطية العامة. القدرة على جمع هذه العينات من خلال نهج مينيملي يعني أن هناك خطر أقل من التهاب المتعلقة بإجراءات من موجود مع تقنيات المنشورة حاليا وتأثير أقل على علم وظائف الأعضاء الحيوانات. في فوتلح، سوف نقوم بتقييم القدرة على الجمع بين مجموعة من MLN والكبد مع مجموعة من الطحال من خلال نفس المواقع ميناء اثنين للسماح لأخذ العينات من جزء آخر مهم ومتميز في الجهاز المناعي التي ثبت أنها تلعب دورا هاما في عدد من النماذج المرض.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة عدد المنح P51OD010425.
Materials
| Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
| Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
| Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
| Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
| Hospira Lactated Ringer's 250 ml | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
| Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
| Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
| 300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
| 460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
| Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
| Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
| Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
| Multipurpose Rigid Scope, 2.7mm x 187.5mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
| Exam and Protective Sheath for 2.7mm x 187.5mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
| Rigid scope, 5mm x 300mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
| Veress Needle, 2mm x 80mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
| Solid Probe with Markings, 5mm x 320mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
| Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5mm x 240mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
| Biopsy Forceps, 3.5mm X 310mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
| Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
| Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
| CO2 | Airgas | CD USPE | |
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
| RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
| Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
| 70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
| 5mL Syringe | BD | 309646 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
| 5mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
| LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
| CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
| PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
| BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
| APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
| PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
| BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
| 16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| LSR II Flow Cytometer | BD | NA |
Referenzen
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Jacobs, J. P., Braun, J. Immune and genetic gardening of the intestinal microbiome. FEBS Lett. 588 (22), 4102-4111 (2014).
- Macpherson, A. J., Smith, K. Mesenteric lymph nodes at the center of immune anatomy. J Exp Med. 203 (3), 497-500 (2006).
- Vaikunthanathan, T., Safinia, N., Lombardi, G., Lechler, R. I. Microbiota, immunity and the liver. Immunol Lett. 171, 36-49 (2016).
- Macpherson, A. J., Heikenwalder, M., Ganal-Vonarburg, S. C. The Liver at the Nexus of Host-Microbial Interactions. Cell Host Microbe. 20 (5), 561-571 (2016).
- Shuai, Z., et al. Adaptive immunity in the liver. Cell Mol Immunol. 13 (3), 354-368 (2016).
- Chun, T. W., et al. Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long-term antiretroviral therapy. J Infect Dis. 197 (5), 714-720 (2008).
- Horiike, M., et al. Lymph nodes harbor viral reservoirs that cause rebound of plasma viremia in SIV-infected macaques upon cessation of combined antiretroviral therapy. Virology. 423 (2), 107-118 (2012).
- North, T. W., et al. Viral sanctuaries during highly active antiretroviral therapy in a nonhuman primate model for AIDS. J Virol. 84 (6), 2913-2922 (2010).
- Xu, H., Wang, X., Lackner, A. A., Veazey, R. S. CD8 down-regulation and functional impairment of SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in lymphoid and mucosal tissues during SIV infection. J Leukoc Biol. 93 (6), 943-950 (2013).
- Zhang, L., Dailey, P. J., Gettie, A., Blanchard, J., Ho, D. D. The Liver Is a Major Organ for Clearing Simian Immunodeficiency Virus in Rhesus Monkeys. Journal of Virology. 76 (10), 5271-5273 (2002).
- Dillon, S. M., et al. An altered intestinal mucosal microbiome in HIV-1 infection is associated with mucosal and systemic immune activation and endotoxemia. Mucosal Immunol. 7 (4), 983-994 (2014).
- Jiang, W., et al. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199 (8), 1177-1185 (2009).
- Sandler, N. G., et al. Plasma levels of soluble CD14 independently predict mortality in HIV infection. J Infect Dis. 203 (6), 780-790 (2011).
- Klase, Z., et al. Dysbiotic bacteria translocate in progressive SIV infection. Mucosal Immunol. 8 (5), 1009-1020 (2015).
- Evans, T. I., et al. SIV-induced Translocation of Bacterial Products in the Liver Mobilizes Myeloid Dendritic and Natural Killer Cells Associated With Liver Damage. J Infect Dis. 213 (3), 361-369 (2016).
- Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2 edn. , (2011).
- Flecknell, P. A. . Laboratory Animal Anaesthesia. 3 edn. , (2009).
- Tranquilli, W. J., Thurnom, J. C., Grimm, K. A. . Lumb and Jones’ Veterinary Anesthesia and Analgesia. , (2007).
- Ford, R. B., Mazzaferro, E. M. . Kirk and Bistner’s Handbook of Veterinary Procedures and Emergency Treatment. 9 edn. , (2012).
- Fransson, B. A., Mayhew, P. D. . Small Animal Laparoscopy and Thoracoscopy. , (2015).
- Hensley-McBain, T., et al. Effects of Fecal Microbial Transplantation on Microbiome and Immunity in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. J Virol. 90 (10), 4981-4989 (2016).
- Smedley, J., et al. Laparoscopic Technique for Serial Collection of Para-Colonic, Left Colic, and Inferior Mesenteric Lymph Nodes in Macaques. PLoS One. 11 (6), 0157535 (2016).
- Park, J., et al. Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR-S6K pathway. Mucosal Immunol. 8 (1), 80-93 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, H. W., Ulevitch, R. J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker. Immunol Today. 14 (3), 121-125 (1993).
- Brenchley, J. M., et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12 (12), 1365-1371 (2006).
