قياس البروتين ملزمة ل F- أكتين بواسطة الترسيب المشترك
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لاختبار قدرة البروتين للمشاركة في الرواسب مع أكتين الخيطية (F- أكتين)، وإذا لوحظ ملزم، لقياس تقارب التفاعل.
Abstract
وينظم تنظيم أكتين الخيطية (F- أكتين) داخل الخلايا من قبل عدد كبير من البروتينات ملزمة أكتين التي تتحكم في تنوي الأكتين، والنمو، عبر ربط و / أو التفكيك. يصف هذا البروتوكول تقنية – الترسيب المشارك أكتين، أو التكوير، فحص – لتحديد ما إذا كان بروتين أو مجال البروتين يربط F- أكتين وقياس تقارب التفاعل ( أي ثابت التفكك التوازن). في هذه التقنية، يتم تحضين بروتين من الفائدة لأول مرة مع F- أكتين في الحل. ثم، يتم استخدام الطرد المركزي التفاضلي لترسيب خيوط أكتين، ويتم تحليل المواد بيليتد بواسطة سدز-بادج. إذا كان البروتين من الفائدة يربط F- أكتين، وسوف يشارك في الرواسب مع خيوط أكتين. ويمكن قياس المنتجات من رد فعل ملزمة ( أي F- أكتين والبروتين من الفائدة) لتحديد مدى تقارب التفاعل. المقايسة أكتين التكوير هو تقنية واضحة لتحديدإذا كان بروتين من الفائدة يربط F- أكتين ولتقييم كيفية التغييرات في هذا البروتين، مثل يجند ملزمة، تؤثر على تفاعلها مع F- أكتين.
Introduction
أكتين هو بروتين الهيكل الخلوي الضروري الذي يلعب دورا حاسما في العمليات الخلوية متعددة، بما في ذلك الحركة، والانكماش، والتصاق، والتشكل 1 . أكتين موجود في شكلين: أكتين كروي أحادي (G- أكتين) وأكتين بلمرة خيطية (F- أكتين). داخل الخلايا، يتم التحكم في التنظيم F- أكتين من قبل مجموعة كبيرة من البروتينات التي تنظم تنوي، والنمو، عبر ربط وتفكيك شعيرات أكتين 2 ، 3 ، 4 . ومع ذلك، كيف العديد من البروتينات ملزمة أكتين تعمل في الحفل لتنظيم تنظيم شبكة أكتين لا يزال غير واضح إلى حد كبير.
قياس التفاعلات البروتين البروتين هو نهج مهم لفهم كيفية بروتينات تمارس آثارها على السلوك الخلوي على مستوى الكيمياء الحيوية. العديد من المقايسات المختلفة يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات بين البروتينات المنقى.وتشمل النهج المشتركة للبروتينات القابلة للذوبان سحب المنسدلة، الاستقطاب مضان، كالوريمتري المعايرة متساوي الحرارة، والرنين بلاسمون السطح. الأهم من ذلك، كل هذه المقايسات تتطلب البروتينات لتكون قابلة للذوبان، وبالتالي من الصعب على التكيف للاستخدام مع البوليمرية، والخيطية البروتين مثل F- أكتين. هنا، نحن تصف تقنية – أكتين المشارك الترسيب، أو التكوير، فحص – لتحديد ما إذا كان بروتين أو مجال البروتين يربط F- أكتين وقياس تقارب التفاعل.
مقايسة التكوير أكتين هي تقنية بسيطة نسبيا التي لا تتطلب معدات متخصصة، وبصرف النظر عن نابذة فائقة السرعة. ويمكن إجراء جميع الكواشف، على افتراض معرفة الكيمياء الحيوية الأساسية، أو شراؤها. مرة واحدة ملزمة ل F- أكتين يتم تأسيسها، ويمكن استخدام مقايسة لقياس تقارب واضح ( أي ثابت التفكك التوازن) 5 . أيضا، مرة واحدة يتم تأسيس تقارب، فحص التكويرهو أداة مفيدة لقياس كيفية التغيرات في البروتين من الفائدة ( أي التعديلات بعد متعدية، الطفرات، أو يجند ملزمة) تؤثر على تفاعلها مع F- أكتين 6 . تقنية لديها قيود (انظر المناقشة ) أن الباحث يجب أن يكون على بينة من قبل محاولة الفحص.
Protocol
Representative Results
Discussion
و أكتين المشارك الترسيب الفحص هو تقنية واضحة التي يمكن أن تحدد بسرعة ما إذا كان البروتين يربط F- أكتين. مع بعض التعديلات، ويمكن أيضا أن تستخدم تقنية لقياس تقارب التفاعل. بالإضافة إلى النقاط التي أثيرت في البروتوكول أعلاه، ينبغي النظر في القضايا التالية عند تصميم وإجراء وتفسير الفحص.
بروتين الفائدة
بروتين الطازجة أو المجمدة يمكن استخدامها في الفحص. إذا تم استخدام البروتين المجمد، فمن المستحسن أن تتم مقارنة النتائج مع الطازجة (أبدا المجمدة) البروتين لضمان أن التجميد لا يؤثر F- أكتين ملزمة.
مصدر أكتين G
العديد من التجارب التكوير استخدام G- أكتين معزولة عن العضلات بسبب وفرة النسبية. هناك ثلاثة أنماط أساسية أكتين في الثدييات – ألفا، بيتا وجاما – التي هي مشابهة بشكل ملحوظ (> 90٪ تسلسل إيدنتيتي واي). ومع ذلك، هناك اختلافات وظيفية بين إيزوتيبس 12 ، 13 . إذا كان ذلك ممكنا، يجب أن يكون إيزوتيب G- أكتين المستخدمة في فحص ملزمة تطابق النمط الظاهري في الجسم الحي . على سبيل المثال، إذا اختبار البروتين أعرب في العضلات والهيكل العظمي، ألفا أكتين هو الخيار الافضل. إذا فحص البروتين أعرب في الخلايا الليفية، ينصح بيتا أكتين.
استخدام فالويدين
منذ فالويدين يربط F- أكتين، فإنه يمكن أن تتدخل أو حتى منع ربط بعض البروتينات ملزم F- أكتين (على سبيل المثال، كتل فالويدين كوفيلين من ربط خيوط أكتين) 14 . وهكذا، فالويدين ينبغي أن تستخدم بحذر والنتائج مقارنة مع عينات غير فالويدين المعالجة عندما يكون ذلك ممكنا.
خلفية عالية
ليس من غير المألوف للبروتينات إلى الرواسب في غياب F- أكتين ( الشكل 1A ، لا F- أكتين بيليه عينةق). ومع ذلك، يمكن لمستويات عالية من الترسيب الخلفية أن تخفي ترسيب الأكتين المشترك الحقيقي وتجعل من الصعب، إن لم يكن من المستحيل، تحديد ما إذا كان البروتين يربط F- أكتين أو لقياس تقارب التفاعل. إضافة بوليديكانول إلى المخزن المؤقت رد فعل (الخطوة 4.1) يمكن أن تقلل بشكل كبير من الخلفية، وهو حل سهل. إذا كان هذا لا يقلل من الخلفية، وضبط المخزن المؤقت رد فعل، تركيز الملح، و / أو درجة حرارة الحضانة قد يساعد.
منحنى ملزم
لتوليد منحنى ملزمة، فمن الضروري أن تختلف تركيز إما البروتين من الفائدة أو F- أكتين على مدى سلسلة من ردود الفعل. في الممارسة العملية، فإنه من الأسهل والأفضل للحفاظ على F- أكتين في تركيز ثابت وتختلف تركيز البروتين من الفائدة. الحفاظ على F- أكتين في تركيز ثابت (على سبيل المثال، 2 ميكرومتر) في مقايسة تكوير حدود محاصرة غير محددة في تركيزات أعلى من F- أكتين ويمنعإزالة البلمرة في تركيزات أقل من (0.5 ميكرومتر) من F- أكتين. يمكن منع إزالة البلمرة باستخدام فالويدين، على الرغم من أن هذا يدخل عامل تعقيد محتمل في النظام (انظر الخطوة 3.3 وما فوق). كما أن الحفاظ على F-أكتين عند تركيز ثابت يسمح لمقارنة (وتطبيع) بيليه F- أكتين عبر العينات وتحديد التجارب الفاشلة ( أي حيث يكون بيليه F- أكتين متغير بدرجة كبيرة، مما يمنع التحليل عبر التركيزات). وأخيرا، والحفاظ على F- أكتين في تركيز ثابت يسمح واحد لتحديد ما إذا كان ملزم خيوط أكتين تعاونية ( الشكل 1C ).
مشبعة ملزمة
كما هو الحال في جميع التجارب ملزمة، فمن الأهمية بمكان أن الربط إلى F- الأكتين مشبعة وأن تركيز البروتين زائد الهضاب F- أكتين ( الشكل 1C ). دون هضبة، فإنه ليس من الممكن لحساب ثابت التفكك ثابت ثابت. وهكذا، فإنهمن المهم أن تخطط بعناية لسلسلة التخفيف ليتم اختبارها ودائما تشمل تركيزات أعلى من البروتين ( أي، على الأقل 5- إلى 10 أضعاف أعلى من المتوقع K د ).
تحليل ملزم
من أجل الثوابت التفكك قياس أن تكون حاسمة، وينبغي إجراء الفحص باستخدام تركيز F- الأكتين الذي يسمح لتركيز مواقع ملزمة على F- أكتين للبروتين من الفائدة لتكون أقل بكثير من تقارب. للتحقق من ما إذا تم استيفاء هذا المعيار، تقدير تركيز مواقع الربط من B ماكس . على سبيل المثال، إذا كان [F- أكتين] 2 ميكرومتر و B ماكس = 0.5، ثم [مواقع ملزمة] ≈ 1 ميكرومتر. وينبغي أن يكون K d على الأقل من 5 إلى 10 أضعاف أكبر من [المواقع الملزمة]. إذا كان المقياس K d من نفس الحجم من حيث [المواقع الملزمة]، فمن الممكن أن يمثل منحنى ملاحظ لوحظ معايرة من عالية تقارب ملزمة سيتيس بدلا من إيسوثرم ملزمة حقيقية. إذا لوحظ هذا، كرر الفحص باستخدام انخفاض 10 أضعاف تركيز F- الأكتين لقياس تقارب دقيق. للتفاعلات عالية تقارب، فالويدين الاستقرار (الخطوة 3.3) قد يكون ضروريا لتحقيق تركيز F- أكتين منخفضة بما فيه الكفاية لقياس تقارب بدقة.
وأخيرا، هناك قيود أساسية مع الفحص المشترك الترسيب أن الباحثين يجب أن يكون على بينة من عند إجراء وتقييم الفحص. الأهم من ذلك، فإن مقايسة الترسيب المشترك لا تنتج ثابت التوازن الحقيقي. يتم فصل المنتجات من ملزمة ( أي البروتين زائد F- أكتين) من المواد المتفاعلة أثناء الطرد المركزي، وعندها يمكن للمنتجات ثم فصل لخلق توازن جديد. ونتیجة لذلك، یمکن أن یخطئ مقیاس الترسیب المشترك أو یخفق في الکشف عن التفاعلات المنخفضة الألفة. منذ العديد من البروتينات المرتبطة أكتين لديها تقارب منخفض ( أي، ميكرومولار) ل F- أكتين، نتيجة سلبية ( <eم> أي، لا يمكن الكشف عنها ملزمة) في الفحص لا يعني بالضرورة أن البروتين لا ربط F- أكتين. كبديل، تيرف القائم على الفحص المجهري، وفحوصات واحدة خيوط ملزمة هي أكثر حساسية وأكثر دقة لتحديد ثابت التفكك (للاستعراضات على هذه التقنية، انظر المراجع 15،16 ). وعلى الرغم من هذه القيود، فإن فحص التكوير هو ضمن وسائل معظم الباحثين، وهو أداة فعالة لتحديد ما إذا كان البروتين يربط F- أكتين وقياس تقارب التفاعل.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة HL127711 ل أفك.
Materials
| Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher Scientific | 46960 |
| S100-AT3 rotor | ThermoFisher Scientific | 45585 |
| Ultracentrifuge tubes – 0.2 ml | ThermoFisher Scientific | 45233 |
| Actin, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8531 |
| Polidicanol (Thesit) | Sigma | 88315 |
| Phalloidin | ThermoFisher Scientific | P3457 |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0862 |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196 |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | M33 |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217 |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 3779 |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 |
| Colloidal Blue Staining Kit | ThermoFisher Scientific | LC6025 |
Referenzen
- Pollard, T. D. Actin and Actin-Binding Proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).
- Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins. Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).
- Lappalainen, P. Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks. Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).
- Mullins, R. D., Hansen, S. D. In vitro studies of actin filament and network dynamics. Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).
- Miller, P. W., et al. Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin. J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).
- Wickline, E. D., et al. alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments. J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).
- Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. . Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
- Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
- Hansen, S. D., et al. alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).
- Perrin, B. J., Ervasti, J. M. The actin gene family: function follows isoform. Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).
- Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).
- Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments. J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).
- Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).
- Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays. Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).
