Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için
Summary
Bu protokol sürekli çevredeki dokulara bozmadan planarian gözleri (optik bardak) çıkarılması için nasıl gösterir. ya bir ensülin iğne ve şırınga kullanılarak, ya da her iki gözü göz rejenerasyon, görsel yenilenme evrimi, ve ışık kaynaklı bir davranışın temel düzenleyici mekanizmalarının soruşturma kolaylaştırmak için kesilip edilebilir.
Abstract
Yetişkin kök hücreleri ve rejeneratif mekanizmaların çalışmada planarya yassı kurtların vivo model sisteminde bir elyaf. Bu onların bol pluripotent kök hücre nüfus ve çoğu hayvanlar için felaket olacaktır yaralanmalar sonrasında tüm hücre ve doku tiplerini rejenere etme kabiliyetine büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Son zamanlarda, planarya göz rejenerasyon için bir model olarak popülerlik kazanmıştır. (Iki doku tiplerinin gibidir: pigment hücreleri ve fotoreseptör) tüm göz yeniden kabiliyetleri görme sistemi rejenerasyonunu düzenleyen mekanizmaların diseksiyon sağlar. Göz ablasyon rejenerasyon büyük ölçüde tek başına göz doku ile sınırlı olduğunu En önemli olan göz spesifik yolları ve mekanizmaları incelemek için (örneğin, başı kesilerek ya da delik açma gibi) diğer tekniklere göre çeşitli avantajlara sahiptir. Bu Video makalenin amacı güvenilir beyni rahatsız veya dokuları çevreleyen olmadan planarian optik fincan nasıl kaldırılacağını göstermektir.solucan ve kurulu bir koloninin bakım kullanımı da tarif edilmektedir. Bu teknik, cerrahi soğuk plaka üzerinde immobilize Planaryalar optik fincan oymak için bir 31 G, 5/16 inç insülin iğne kullanır. Bu yöntem geniş bir uygulama yelpazesi için izin 1-2 hafta içinde rejenere gözlü, tek ve çift göz ablasyon kapsar. Özel olarak, bu ablasyon tekniği kolayca rejeneratif mekanizmaları ve evrim, göz kök hücreleri ve bakım ve phototaxic davranışsal tepkileri ve nörolojik olarak daha iyi anlaşılması için farmakolojik ve genetik (RNA interferansı) ekranları ile birleştirilebilir.
Introduction
Planaryalar yetişkin kök hücre aracılı yenilenmeyi incelerken için güçlü bir model organizma bulunmaktadır. Bu parazitik olmayan tatlı su yassı kurtların, merkezi sinir sistemi ve beyin 1 de dahil olmak üzere her türlü kayıp dokuları, yeniden yeteneği gösterirler. (In situ hibridizasyon, immünohistokimya, RNA interferans (RNAi), ve transkriptomik içinde, örneğin, bir sıralı genom olarak) kadar geri son 10-15 yılda planarian alanında 1700 2, teknolojik gelişmeler olarak ele bu tarihi organizma olduğu güncellenmiş . Özellikle, planarya geçenlerde göz araştırma 3 yükselen bir model olarak popülerlik kazanmıştır.
Planaryalar iki doku tipleri, fotoreseptör nöronlar ve pigment hücreleri ile prototipik gözleri; Bu onun göz kök hücre popülasyonunun karakterizasyonu etkin ve aynı genlerin birçoğu omurgalı gözü DE düzenleyen olduğunu göstermiştirvelopment Planaryalar 4, 5 muhafaza edilir. Optik bardak dorsal olarak bulunur ve fotoreseptör nöronların beyaz, pigmentsiz dendrit ve yarım ay siyah pigment yapan hücrelerden, ve bunun üzerine kiyazmanın ile beyin innerve edilir. Yeniden yaratıcı süreçler, 6 açıklık için bir model olmasının yanı sıra, planarian göz görme mekanizmaları 7 evrim eğitimi için uygundur, davranışsal tepkileri ışığa 8 ve davranış 9 nörolojik temeli (planarya negatif phototaxis ekran).
Planaryalar Göz rejenerasyon büyük ölçüde iki ana bağlamlarda incelenmiştir: Baş yenilenme parçası başının kesilmesini 4, 10 takip ve sadece göz dokularının 11 eksizyonu aşağıdaki gibi 12 </> Sup. Basit ve anlaşılır olarak göz yenilenmesine En planarian çalışmalar decapitation yöntemini kullanmışlardır. Bazı çalışmalar, sadece göz (kısmi dekapitasyon) 15 arkasında amputasyon gerçekleştirilir rağmen bugüne kadar en yaygın planarian göz eksizyon yöntem olup, ince bir cam kılcal boru 13, 14 ile delik açma ile olmuştur. Bununla birlikte, bu yöntemlerin tüm potansiyel olarak, sonuçların yorumunu komplike (örneğin, beyin, bağırsak, ve nephridia gibi) sadece göz dışındaki birçok doku kaybını içermektedir. Burada sunulan göz ablasyon protokolü göze daha özeldir verilerin ortaya çıkmasına neden (özellikle beyinde hariç) göz dokularına, eksizyonu kısıtlar. Ayrıca, beslenme başlamak için 7-14 gün sürebilir kafası kesilmiş solucanlar aksine, göz kesilip solucanlar performe edilmesi (RNAi gıda ile teslim edilir) RNAi deneyleri izin ablasyon 12 24 saat içinde besleyecekeş zamanlı d.
Göz ablasyon başarılı dekapitasyon daha gerçekleştirmek için teknik olarak zor olsa da, göz eksizyonu içeren güncel çalışmalar onların prosedürlerine ilişkin ayrıntılı talimatlar yer verilmemiştir. Bu video makalede amacı sürekli altta yatan beyin dokuları rahatsız ve mümkün olduğunca az diğer dokulara çıkarmadan planarian optik fincan kaldırmak için araştırmacılar sağlamaktır. Bu yöntem hem tek ve çift göz yakmakta ve araştırmaların geniş bir yelpazede uygulanabilir edilebilir. En yenilenmesi deneylerinde olduğu gibi, göz ablasyon farmakolojik ve genetik (RNAi) ekranlar, hem de davranışsal çalışmalar her iki kombinasyon için uygundur. Burada, solucan işlenmesi için yöntemler tarif bir planarian koloni bakımı ve göz ablasyon tekniği kendisi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu göz ablasyon tekniği beyin dokusu hariç ve göz dokuları için esas eksizyon kısıtlayarak (örneğin, delikli zımba gibi) mevcut yöntemlerle daha da iyileştirir. teknisyenler deneyimsiz ama vicdani lisans öğrencilerine microsurgeries yaşanan den uygulama ile, bu teknik, çoğu kişiler tarafından yapılabilir. Tekniğin önceki immünohistokimya ile ya da göz işaretçi (ler) 4, 5, 13 için in situ mel…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar işlevsel tahlil ile yardım için bu göz ablasyon tekniği, Taylor Birkholz mükemmelleştirmek için Michelle Deochand teşekkür etmek istiyorum, Peltier plakaları hakkında bilgi almak için, anti-arrestin antikoru Michael Levin ve Junji Morokuma. Bu çalışma WSB Batı Michigan Üniversitesi'nden SFSA hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands | SS15-10 | "10 Gallon" box (net weight 3 lbs) |
| Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe | Kimberly-Clark | 34155 | 4.5 x 8.5 in |
| Whatman #2 filter paper | Sigma | WHA1002125 | Circles, 125 mm diameter, white |
| Easy Touch Insulin syringe (with needle) | Pet Health Market | 17175-04 | U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 x 15 mm |
| 60 mm Petri dish | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Inox, straight tip , 11 cm |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile |
| Parafilm M paraffin film | Brand | 701606 | 4 in x 125 ft roll |
| 12-well untreated tissue culture plate | VWR | 15705-059 | Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand |
| Plastic food containers (for colony) | Ziploc | Large rectangle | 2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16" |
| Planaria (Girardia tigrina) | Carolina Biological | 132954 | Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work. |
| Planaria (Schmidtea mediterranea) | n/a | n/a | S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals. |
| Brown paper towels | Grainger | 2U229 | 9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED |
| Wash bottle (for worm water), optional | VWR | 16650-275 | Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL |
| Anti-synapsin antibody, optional | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Supernatant |
| Anti-arrestin antibody, optional | n/a | n/a | Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University |
| Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional | Nalge Nunc International Corporation | 2324-0015 | 15 L, polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers |
| Custom Peltier plate, optional | Williams Machine, Foxboro, MA | n/a | Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University: Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2). The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate. |
| DC power source (for Peltier plate), optional | B & K Precision | 1665 | Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps. |
| Other common supplies | |||
| Gloves | |||
| Razor blade | |||
| Scissors | |||
| Dissecting scope with gooseneck lighting | |||
| Chopstick rests, optional |
Referenzen
- Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration. Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).
- Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (3), 301-326 (2013).
- Emili Saló, R. B., Tsonis, P. A. Chapter 3. Animal Models in Eye Research. , 15-26 (2008).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye. PLoS Genet. 7 (8), e1002226 (2011).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. Transcriptome analysis of the planarian eye identifies ovo as a specific regulator of eye regeneration. Cell Rep. 2 (2), 294-307 (2012).
- Inoue, T., et al. Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration. Zoolog Sci. 21 (3), 275-283 (2004).
- Pineda, D., et al. The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent. Development. 129 (6), 1423-1434 (2002).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9 (12), e114708 (2014).
- Raffa, R. B., Martley, A. F. Amphetamine-induced increase in planarian locomotor activity and block by UV light. Brain Res. 1031 (1), 138-140 (2005).
- Sandmann, T., Vogg, M. C., Owlarn, S., Boutros, M., Bartscherer, K. The head-regeneration transcriptome of the planarian Schmidtea mediterranea. Genome Biol. 12 (8), R76 (2011).
- Vasquez-Doorman, C., Petersen, C. P. The NuRD complex component p66 suppresses photoreceptor neuron regeneration in planarians. Regeneration (Oxf). 3 (3), 168-178 (2016).
- Deochand, M. E., Birkholz, T. R., Beane, W. S. Temporal regulation of planarian eye regeneration. Regeneration. 3 (4), 209-221 (2016).
- Sakai, F., Agata, K., Orii, H., Watanabe, K. Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians -eye regeneration field and pathway selection by optic nerves. Zoolog Sci. 17 (3), 375-381 (2000).
- Asano, Y., Nakamura, S., Ishida, S., Azuma, K., Shinozawa, T. Rhodopsin-like proteins in planarian eye and auricle: detection and functional analysis. J Exp Biol. 201 (Pt 9), 1263-1271 (1998).
- Cross, S. D., et al. Control of Maintenance and Regeneration of Planarian Eyes by ovo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7604-7610 (2015).
- Robb, S. M., Gotting, K., Ross, E., Sanchez Alvarado, A. SmedGD 2.0: The Schmidtea mediterranea genome database. Genesis. 53 (8), 535-546 (2015).
- Robb, S. M., Ross, E., Sanchez Alvarado, ., A, SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database. Nucleic Acids Res. 36, D599-D606 (2008).
- Beane, W. S., Tseng, A. S., Morokuma, J., Lemire, J. M., Levin, M. Inhibition of planar cell polarity extends neural growth during regeneration, homeostasis, and development. Stem Cells Dev. 21 (12), 2085-2094 (2012).
- Forsthoefel, D. J., Waters, F. A., Newmark, P. A. Generation of cell type-specific monoclonal antibodies for the planarian and optimization of sample processing for immunolabeling. BMC Dev Biol. 14, 45 (2014).
- Ross, K. G., et al. Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians. BMC Dev Biol. 15, 2 (2015).
- Cardona, A., Fernandez, J., Solana, J., Romero, R. An in situ hybridization protocol for planarian embryos: monitoring myosin heavy chain gene expression. Dev Genes Evol. 215 (9), 482-488 (2005).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev Biol. 13, 8 (2013).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev Dyn. 238 (2), 443-450 (2009).
