Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras el desafío bacteriano de las células de mamíferos
Summary
Describimos un método para el análisis cualitativo y cuantitativo de la formación de gránulos de estrés en células de mamíferos después de que las células son desafiadas con bacterias y una serie de diferentes tensiones. Este protocolo puede aplicarse para investigar la respuesta de los gránulos de estrés celular en una amplia gama de interacciones huésped-bacteriana.
Abstract
La imagen fluorescente de los componentes celulares es una herramienta eficaz para investigar las interacciones huésped-patógeno. Los patógenos pueden afectar muchas características diferentes de las células infectadas, incluyendo ultraestructura de organelos, organización de la red del citoesqueleto, así como procesos celulares como la formación de gránulos de estrés (SG). La caracterización de cómo los patógenos subvertir procesos de acogida es una parte importante e integral del campo de la patogénesis. Mientras que los fenotipos variables pueden ser fácilmente visibles, el análisis preciso de las diferencias cualitativas y cuantitativas en las estructuras celulares inducidas por el desafío del patógeno es esencial para definir diferencias estadísticamente significativas entre muestras experimentales y de control. La formación de SG es una respuesta de estrés evolutivamente conservada que conduce a respuestas antivirales y se ha investigado durante mucho tiempo utilizando infecciones virales 1 . La formación de SG también afecta a las cascadas de señalización y puede tener otras consecuencias aún desconocidas2 . La caracterización de esta respuesta de estrés a patógenos distintos de los virus, como los patógenos bacterianos, es actualmente un área de investigación emergente 3 . Por ahora, el análisis cuantitativo y cualitativo de la formación de SG aún no se utiliza rutinariamente, incluso en los sistemas virales. Aquí describimos un método sencillo para inducir y caracterizar la formación de SG en células no infectadas y en células infectadas con un patógeno bacteriano citosólico, lo que afecta a la formación de SGs en respuesta a diversas tensiones exógenas. El análisis de la formación y composición de SG se logra utilizando un número de diferentes marcadores SG y el detector de puntos del plug-in ICY, una herramienta de análisis de imágenes de código abierto.
Introduction
La visualización de las interacciones huésped-patógeno a nivel celular es un método poderoso para obtener información sobre las estrategias patógenas y para identificar las vías celulares clave. De hecho, los patógenos pueden utilizarse como herramientas para identificar objetivos o estructuras celulares importantes, ya que los patógenos han evolucionado para subvertir los procesos celulares centrales como una estrategia para su propia supervivencia o propagación. La visualización de componentes celulares puede conseguirse mediante la expresión recombinante de proteínas huésped marcadas fluorescentemente. Aunque esto permite el análisis en tiempo real, la generación de líneas celulares con proteínas huésped marcadas específicamente es muy laboriosa y puede dar lugar a efectos secundarios indeseables. Más conveniente es la detección de factores celulares utilizando anticuerpos específicos, porque múltiples factores del huésped pueden ser analizados simultáneamente y uno no se limita a un tipo de célula particular. Un inconveniente es que sólo se puede captar una vista estática, ya que el análisis de inmunofluorescencia requiere un fijador de células huéspedion. Sin embargo, una ventaja importante de la inmunofluorescencia es que se presta fácilmente al análisis cualitativo y cuantitativo. Esto, a su vez, puede utilizarse para obtener diferencias estadísticamente significativas para proporcionar nuevos conocimientos sobre las interacciones huésped-patógeno.
Los programas de análisis de imágenes fluorescentes son poderosas herramientas analíticas para realizar análisis 3D y 4D. Sin embargo, el alto costo del software y su mantenimiento hacen que los métodos basados en software libre libre sean más atractivos. El análisis cuidadoso de la imagen usando el software del bio-análisis es valioso como substancia el análisis visual y, al asignar significados estadísticos, aumenta confianza en la exactitud de un fenotipo dado. Anteriormente, las SG se analizaron utilizando el software gratuito ImageJ, que requiere la identificación manual de cada SG 4 . Aquí se proporciona un protocolo para la inducción y el análisis de la formación de SG celular en el contexto de bacUtilizando el software gratuito de análisis de bioimágenes de código abierto ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). El software de análisis de imágenes biológicas tiene un programa de detección de manchas integrado que es muy adecuado para el análisis de SG. Permite el ajuste fino del proceso de detección automatizado en regiones de interés especificadas (ROIs). Esto supera la necesidad de un análisis manual de SG individuales y elimina el sesgo de muestreo.
Muchas tensiones ambientales inducen la formación de SGs, que son estructuras citosólicas, no membranosas, de densidad de fase de 0,2 – 5 μm de diámetro 5,6 . Esta respuesta celular se conserva evolutivamente en levaduras, plantas y mamíferos y ocurre cuando se inhibe la traducción global de proteínas. Implica la agregación de complejos de iniciación de traducción estancados en SGs, que se consideran lugares de retención para mRNAs translacionalmente inactivos, permitiendo la traducción selectiva de un subconjunto de mRNAs celulares.Tras la eliminación del estrés, los SG se disuelven y se reanudan las tasas globales de síntesis de proteínas. Las SG se componen de factores de iniciación de la elongación de la traducción, proteínas implicadas en el metabolismo del ARN, proteínas de unión a ARN, así como proteínas de andamio y factores implicados en la señalización de células hospedadoras 2 , aunque la composición exacta puede variar dependiendo de la tensión aplicada. Los factores ambientales que inducen la formación de SG incluyen la inanición de aminoácidos, la irradiación UV, el choque térmico, el choque osmótico, el estrés del retículo endoplásmico, la hipoxia y la infección viral 2 , 7 , 8 . Se ha avanzado mucho en la comprensión de cómo los virus inducir y también subvertir la formación de SG, mientras que todavía poco se sabe acerca de cómo otros patógenos, como patógenos bacterianos, hongos o protozoarios, afectan a esta respuesta al estrés celular 1 , 7 .
ShigeLla flexneri es un patógeno citosólico facultativo gramnegativo de los seres humanos y el agente causante de la diarrea o shigelosis severa. La shigelosis es una importante carga de salud pública y causa 28.000 muertes anuales en niños menores de 5 años 9 , 10 . S. flexneri infecta el epitelio del colon y se extiende célula a célula mediante el secuestro de los componentes del citoesqueleto del huésped [ 11 , 12] . La infección del epitelio apoya la replicación de S. flexneri dentro del citosol, pero los macrófagos infectados mueren a través de un proceso inflamatorio de muerte celular llamado piroptosis. La infección conduce a un reclutamiento masivo de neutrófilos e inflamación severa que es acompañada por calor, estrés oxidativo y destrucción de tejidos. De este modo, mientras que las células infectadas están sujetas a tensiones internas inducidas por la infección, tales como la interrupción de Golgi, estrés genotóxico y reordenamiento citoesqueléticoS, las células infectadas también están sometidas a tensiones ambientales debidas al proceso inflamatorio.
Caracterización del efecto de la infección por S. flexneri sobre la capacidad de las células para responder a las tensiones ambientales utilizando un número de marcadores SG ha demostrado que la infección conduce a diferencias cualitativas y cuantitativas en la composición SG 3 . Sin embargo, se sabe poco sobre otros patógenos bacterianos. Aquí se describe una metodología para la infección de las células huésped con el patógeno citosólico S. flexneri , el estresamiento de las células con diferentes tensiones ambientales, el etiquetado de los componentes SG y el análisis cualitativo y cuantitativo de la formación y composición SG en el contexto de la infección Y células no infectadas. Este método es ampliamente aplicable a otros patógenos bacterianos. Además, el análisis de imagen de la formación de SG puede usarse para infecciones por virus u otros patógenos. Se puede utilizar para analizar SGFormación tras la infección o el efecto de la infección en la formación de SG en respuesta a tensiones exógenas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí describe la inducción, localización y análisis de SGs en células no infectadas y células infectadas con el patógeno citosólico S. flexneri en presencia o ausencia de estrés exógeno. Usando software de imagen libre, los protocolos permiten el análisis cualitativo y cuantitativo preciso de la formación de SG para identificar y tratar estadísticamente las diferencias en fenotipos dados.
Hay varios pasos críticos dentro del protocolo para la infe…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PS es un ganador de la Bill y Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV recibió el apoyo de una beca de Postdoc Mobility de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza y una beca postdoctoral Roux-Cantarini. PJS es compatible con una subvención HHMI y ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
Materials
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1 in 300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1 in 500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1 in 500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth |
| Poly L lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture |
| DMEM | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture |
| Fetal calf serum | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application – cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application – cell culture |
| 12-mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application – image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application – data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application – data analysis | |
Referenzen
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
- Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
- Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).
- Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
- Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
- Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
- Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
- Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
- Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).
