Analisi dell'immunofluorescenza della formazione di granuli di stress dopo la sfida batterica delle cellule dei mammiferi
Summary
Descriviamo un metodo per l'analisi qualitativa e quantitativa della formazione di granuli di stress nelle cellule dei mammiferi dopo che le cellule sono sfidate con batteri e una serie di sollecitazioni diverse. Questo protocollo può essere applicato per indagare la risposta del granulo di stress cellulare in una vasta gamma di interazioni ospedaliere-batteriche.
Abstract
L'imaging fluorescente dei componenti cellulari è uno strumento efficace per indagare le interazioni host-patogeno. I patogeni possono influenzare molteplici caratteristiche delle cellule infette, tra cui l'organologia ultrastruttiva, l'organizzazione della rete citoscheletrica, nonché i processi cellulari come la formazione di Stress Granule (SG). La caratterizzazione di come i patogeni subiscono i processi dell'host è una parte importante e integrale del campo della patogenesi. Mentre i fenotipi variabili possono essere facilmente visibili, l'analisi precisa delle differenze qualitative e quantitative nelle strutture cellulari indotte dalla sfida patogena è essenziale per definire differenze statisticamente significative tra i campioni sperimentali e quelli di controllo. La formazione di SG è una risposta a stress evolutivamente conservata che conduce alle risposte antivirali e è stata da tempo studiata usando infezioni virali 1 . La formazione di SG influenza anche le cascate di segnalazione e possono avere altri conseq ancora sconosciuti2 . La caratterizzazione di questa risposta allo stress a patogeni diversi dai virus, come gli agenti patogeni batterici, è attualmente un'area emergente di ricerca 3 . Per ora, l'analisi quantitativa e qualitativa della formazione SG non è ancora abitualmente usata, anche nei sistemi virali. Qui descriviamo un metodo semplice per indurre e caratterizzare la formazione di SG in cellule non infettate e in cellule infettate da un patogeno batterico citosolico, che influenza la formazione di SG in risposta a varie sollecitazioni esogene. L'analisi della formazione e della composizione SG è ottenuta utilizzando un certo numero di differenti marcatori SG e il plug-in del rilevatore spot di ICY, uno strumento di analisi delle immagini open source.
Introduction
Visualizzare le interazioni host-patogeni a livello cellulare è un metodo potente per ottenere approfondimenti sulle strategie patogene e per identificare i principali percorsi cellulari. Infatti, gli agenti patogeni possono essere utilizzati come strumenti per individuare importanti bersagli o strutture cellulari, in quanto gli agenti patogeni si sono evoluti per subire i processi cellulari centrali come una strategia per la loro sopravvivenza o la loro propagazione. La visualizzazione dei componenti cellulari può essere ottenuta mediante espressione recombinante di proteine ad oscillazioni fluorescenti. Mentre questo consente l'analisi in tempo reale, la generazione di linee cellulari con proteine ad hoc specifiche tagliate è altamente laboriosa e può causare effetti indesiderati indesiderati. Più conveniente è la rilevazione di fattori cellulari che utilizzano anticorpi specifici, in quanto possono essere analizzati simultaneamente più fattori host e non si limitano ad un particolare tipo di cellula. Un inconveniente è che solo una visione statica può essere catturata in quanto l'analisi dell'immunofluorescenza richiede il fixat delle cellule hostionico. Tuttavia, un importante vantaggio dell'immagine di immunofluorescenza è che si presta facilmente ad analisi qualitative e quantitative. Questo a sua volta può essere utilizzato per ottenere differenze statisticamente significative per fornire nuove conoscenze sulle interazioni host-patogeno.
I programmi di analisi fluorescenti delle immagini sono potenti strumenti analitici per eseguire analisi 3D e 4D. Tuttavia, l'elevato costo del software e la sua manutenzione fanno dei metodi basati sul libero software open source più ampiamente attraenti. L'analisi approfondita dell'immagine usando il software di bioanalisi è preziosa in quanto dimostra l'analisi visiva e, quando assegna significati statistici, aumenta la fiducia nella correttezza di un determinato fenotipo. In precedenza, gli SG sono stati analizzati utilizzando il software gratuito ImageJ, che richiede l'identificazione manuale dei singoli SG4. Qui forniamo un protocollo per l'induzione e l'analisi della formazione cellulare SG nel contesto di bacLe infezioni da virus utilizzando il software gratuito di analisi bio-immagine open source ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Il software per l'analisi bio-image è dotato di un programma di rivelatore spot che è adatto per l'analisi SG. Consente di ottimizzare il processo di rilevamento automatico in specifiche aree di interesse (ROI). Ciò supera la necessità di analisi manuale dei singoli SG e rimuove la bias di campionamento.
Molte sollecitazioni ambientali inducono la formazione di SG, che sono strutture fisiologiche citocholiciche, non membranose di 0,2-5 μm di diametro 5 , 6 . Questa risposta cellulare è evolutamente conservata in lieviti, piante e mammiferi e si verifica quando la traduzione globale delle proteine è inibita. Comprende l'aggregazione di complessi di iniziazione di traduzione bloccati in SG, considerati come luoghi di detenzione per mRNA traslazionale-inattivi, consentendo la traduzione selettiva di un sottoinsieme di mRNA cellulari.Dopo la rimozione dello stress, SG si dissolvono e il tasso globale di sintesi proteica riprende. Gli SG sono composti da fattori di innesco di allungamento della traduzione, proteine coinvolte nel metabolismo RNA, proteine legate all'RNA, nonché proteine di ponteggio e fattori coinvolti nella segnalazione delle cellule ospite 2 , anche se la composizione esatta può variare a seconda dello stress applicato. I fattori ambientali che inducono la formazione di SG includono la fame di aminoacidi, irraggiamento UV, shock termico, shock osmotico, stress reticolare endoplasmatico, ipossia e infezione virale 2 , 7 , 8 . Molti progressi sono stati fatti per comprendere come i virus inducano e sovvertire la formazione di SG, mentre poco si sa ancora su come altri agenti patogeni, quali batteri, funghi o patogeni protozoi, influenzino questa risposta cellulare 1 , 7 .
ShigeLla flexneri è un patogeno citosolico facoltativo Gram-negativo di esseri umani e l'agente causale di grave diarrea o shigellosis. La Shigellosis è un grave onere della sanità pubblica e porta a 28.000 morti ogni anno nei bambini di età inferiore ai 5 anni 9 , 10 anni . S. flexneri infetta l'epitelio colonico e si diffonde da cellula a cellula perrottando i componenti citoscheletrici dell'host 11 , 12 . L'infezione dell'epitelio supporta la replica di S. flexneri all'interno del citosolo, ma i macrofagi infetti muoiono attraverso un processo di morte delle cellule infiammatorie chiamato pyroptosis. L'infezione porta ad un massiccio reclutamento di neutrofili e infiammazioni gravi che sono accompagnate da calore, stress ossidativo e distruzione dei tessuti. Pertanto, mentre le cellule infette sono soggette a sollecitazioni interne indotte dall'infezione, come la disfunzione di Golgi, lo stress genotossico e il riarrangiamento citoscheletricoLe cellule infette sono sottoposte anche a stress ambientali dovuti al processo infiammatorio.
La caratterizzazione dell'effetto dell'infezione di S. flexneri sulla capacità delle cellule di rispondere alle sollecitazioni ambientali con un numero di marcatori SG ha dimostrato che l'infezione porta a differenze qualitative e quantitative nella composizione SG 3 . Tuttavia, poco si sa di altri patogeni batterici. Qui descriviamo una metodologia per l'infezione di cellule ospitanti con il patogeno citosolico S. flexneri , l'accentuazione delle cellule con differenti sollecitazioni ambientali, l'etichettatura dei componenti SG e l'analisi qualitativa e quantitativa della formazione e della composizione SG nel contesto di infetti E le cellule non infette. Questo metodo è ampiamente applicabile ad altri patogeni batterici. Inoltre, l'analisi delle immagini della formazione SG può essere utilizzata per infezioni da virus o da altri agenti patogeni. Può essere utilizzato per analizzare SGFormazione sull'infezione o sull'effetto dell'infezione sulla formazione di SG in risposta a sollecitazioni esogene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui descrive l'induzione, la localizzazione e l'analisi di SG in cellule non infette e nelle cellule infette con il patogeno citosolico S. flexneri in presenza o in assenza di stress esogeno. Utilizzando il software di imaging gratuito, i protocolli consentono l'analisi precisa qualitativa e quantitativa della formazione SG per individuare e confrontare statisticamente le differenze in determinati fenotipi.
Ci sono diversi passaggi critici all'…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PS è un destinatario della Gran e del Gran Premio di Sfida Melinda Gates OPP1141322. PV è stato sostenuto da una borsa di studio della Posta Nazionale della Scienza Nazionale della Scienza Nazionale e una borsa post-dottorale Roux-Cantarini. PJS è supportato da una sovvenzione HHMI e ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
Materials
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1 in 300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1 in 500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1 in 500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth |
| Poly L lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture |
| DMEM | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture |
| Fetal calf serum | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application – cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application – cell culture |
| 12-mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application – image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application – data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application – data analysis | |
Referenzen
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