Summary

Индукция мезенхимных-эпителиальных переходы в клетках саркомы

Published: April 07, 2017
doi:

Summary

Мы представляем здесь способ культивирования клеток для индукции мезенхимальных-эпителиальные переходы (MET) в клетках саркомы на основе комбинированного эктопической экспрессии микроРНК-200 членов семьи и grainyhead-типа 2 (GRHL2). Этот метод подходит для лучшего понимания биологического воздействия фенотипической пластичности на агрессивности рака и лечении.

Abstract

Фенотипическая пластичность относится к явлению, в котором клетка транзиторна получить черты другого рода. Во время прогрессирования рака, фенотипическая пластичность дисков вторжения, распространение и метастазирование. В самом деле, в то время как большинство исследований фенотипической пластичности было в контексте эпителиальных полученных карцином, оказывается, саркомы, которые являются мезенхимальными по происхождению, также демонстрируют фенотипическую пластичность, с подмножеством сарком переживают феномен, который напоминает mesenchymal- эпителиальный переход (МЕТЫ). Здесь, мы разработали способ, включающий семейство микроРНК-200 и grainyhead-типа 2 (GRHL2), чтобы имитировать этот MET-подобный феномен, наблюдаемый в саркому пациента samples.We последовательно выразить GRHL2 и семейство микроРНК-200 клеток с помощью трансдукции и трансфекции, соответственно, , чтобы лучше понять молекулярные основы этих фенотипических переходов в клетках саркомы. Саркома клетки, экспрессирующие MIR-200s и GRHL2 продемонстрировал повышенную эпителиальной characteristИКС в морфологии клеток и изменения эпителиальных и мезенхимальных биомаркеров. Дальнейшие исследования с использованием этих методов могут быть использовано, чтобы лучше понять последствия фенотипических из МЕТ-подобных процессов на клетки саркомы, такие как миграция, инвазия, метастатическая склонность и устойчивость к терапии.

Introduction

Фенотипическая пластичность относится к обратимому переходу между клеточными фенотипами, и обычно делится на два типа, эпителиально-к-мезенхимальный (ЕМТ) переходы и мезенхимальных-к-эпителиальные переходы (Met). Это фенотипическая пластичность играет важную роль в нормальных процессах многоклеточных организмов, такие как развитие и заживление ран 1; Однако, эти же пути и программа экспрессии генов также могут привести к болезни, такие как фиброз (обзор в 2, 3, 4) и карциноме метастазы (обзор в ссылках 5, 6, 7, 8). Во время метастазирования, например, ЕМТ нарушает полярность клеток, межклеточные взаимодействия, а также способствует инвазии 9, 10. Вместе EMT вкладs в фенотипическое состояние, что способствует распространению раковых клеток. Кроме того, ЕМТ также приводит к целому ряду других фенотипических изменений , которые ведут агрессивный фенотип, в то числе дерегуляции раковых клеток метаболизма 6, развития лекарственной устойчивости 11, 12, увеличенная способностью опухоли инициации 13, 14 и принимающей иммунное уклонение от 15.

Фенотипическая пластичность хорошо изучена в прогрессировании рака; Однако, саркомы также демонстрируют фенотипическую пластичность. Интересно, что кажется, как будто некоторые из тех же водителей фенотипической пластичности в карциномах также способствуют саркомам пластичности и агрессивности. Так , например, циркулирующие опухолевые клетки (CTCs) у пациентов с саркомой , как были показаны , чтобы выразить EpCAM, белок клеточной поверхности , которые , как правило , найденные на эпителиальные клетках 16. Аддиционно, 250 мягких тканей саркома образцы были классифицированы как эпителиальные-типа или мезенхимальные-как на основе экспрессии генов. Пациенты в эпителиального типа биомаркеров подписи имели лучший прогноз , чем у пациентов с мезенхимальной типа биомаркеров подписи 17. Это согласуется со многими карцином, в которых пациенты с более эпителиальных карцином , как имеют лучшие результаты по сравнению с пациентами с более мезенхимальных подобных опухолей 18.

В то время как некоторые саркомы отображения биомаркеров и экспрессии генов пути в соответствии с MET, молекулярные подкрепления этой фенотипической пластичности остаются мало изучены. Изучить механизмы и движущие MET саркомы мы разработали модель MET индукции с использованием двух факторов эпителиальных конкретным, микроРНК (микроРНК) -200 семьи и grainyhead типа 2 (GRHL2). В MIR-200s представляют собой семейство небольших некодирующих РНК, которые регулируют экспрессию генов путем связывания с 3'-UTRs в MESSENгер РНК и предотвращения перевода в белок. МикроРНК-200 семейство состоит из двух подгрупп – один, содержащий MIR-141 и MIR-200a, а другой в том числе MIR-200b, MIR-200c, и MIR-429. Члены семейства микроРНК-200 обогащены эпителиальных тканей, а потеря MIR-200s связан с метастазами в карцином 19. Семейство микроРНК-200 также подавляется в сарком мягких тканей по сравнению с нормальной тканью 20. Подобно MIR-200s, GRHL2 является ключевым регулятором , который имеет важное значение для развития эпителиальных 21. Фактор транскрипции GRHL2 действует в двух способах активируют эпителиальные гены, такие как E-кадгерин: 1) В эпителиальных клетках, GRHL2 непосредственно репрессирует главный регулятор ЕМТА, ZEB1 22; и 2) GRHL2 непосредственно активирует транскрипцию генов эпителиальных 23. Наши предыдущие исследования показали, что комбинированное выражение MIR-200s и GRHL2 в клетках саркомыиндуцирует МЕТ-подобный фенотип 24. Здесь мы представляем подробный протокол для создания модели ин витро MET индукции в клетках саркомы с помощью эктопической экспрессии микроРНК-200s и GRHL2.

Protocol

1. Приготовление реагентов Подготовка DMEM для культивирования клеток путем добавления 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 5 ​​мл пенициллина-стрептомицина (5000 ед / мл) до 500 мл DMEM. Эта среда может храниться при температуре 4 ° С в течение до шести месяцев. Ресуспендируют лиофи?…

Representative Results

Схема для MET индукции в клетках саркомы Общий график для индукции МЕТ-подобных изменений в клетках саркомы показан на рисунке 1. Протокол начинается трансдукции GRHL2 (Фигура 1А), а затем путем трансфекции семейства микро?…

Discussion

Саркомы являются редкими, но очень агрессивные раковые мезенхимной линии. Несмотря на их мезенхимальное происхождение, подмножество сарком, как представляется, пройти фенотипический переход к более эпителиальным подобным состояниям. Это МЕТ-подобный переключатель имеет прогностиче…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JAS признает поддержку со стороны Института Дьюка рака, мочеполовой онкологической лаборатории Duke University и Университета Дьюка отдела ортопедии. HL была поддержана Национальным научным фондом (NSF) Центр теоретической биологической физики (НФС PHY-1427654) и NSF DMS-1361411, а также в качестве CPRIT (Профилактика рака и Научно-исследовательский институт Техас) Scholar в Cancer Research штата Техас в университете Райса. KEW была поддержана NIH F32 CA192630 MKJ и HL выгоду от полезных дискуссий с Мэри C Фарак-Carson, JN Onuchic Самир M Ханаш, Кеннет J Пиента и Дональд S Коффи.

Materials

Countess automated counter Life technologies AMQAX1000
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher A24811
Odyssey Fc LI-COR Inc
ViiA7 Real Time PCR System Thermo Fisher 4453536
PCR microplate Corning 321-29-051
KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit KAPA Biosystems KK4602
Starting Block (PBS) Blocking Buffer Thermo Fisher 37538 BSA-based blocking buffer
Agarose General Purpose LE Genesee Scientific 20-102
10X Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-Rad Laboratories Inc 161-0732 Running buffer
10X Tris/Glycine Buffer Bio-Rad Laboratories Inc 161-0734 Transfer buffer
RIPA Buffer Sigma Life Sciences SLBG8489
Amersham Protran 0.45 μm nitrocellulose GE Healthcare Lifesciences 10600012
Quick-RNA MiniPrep Kit Genesee Scientific 11-358
Laemmli Sample Buffer (4X) Bio-Rad Laboratories Inc 1610747
Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad Laboratories Inc 1703930
Mini-Protean Tetra Cell Bio-Rad Laboratories Inc 1658005EDU
DPBS Life technologies 14190-144
0.05% Trypsin-EDTA Life technologies 11995-065
DMEM Life technologies 11995-065
Lipofectamine RNAi Max Thermo Fisher 13778150
Lipofectamine 2000 Ragents Thermo Fisher 11668019
Penicillin Streptomycin Life technologies 15140-122
miRVana miRNA mimic negative control #1 Thermo Fisher 4464058 neg miRNA
hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4464066 miR200A
has-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4404066 miR200B
has-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4404066 miR200C
Opti-MEM Life technologies 11088-021 serum-free media
anti-Ecadherin antibody BD Bioscience 610182
anti-beta actin Santa Cruz Biotechnology sc-69879
anti-EpCam Ab Serotec MCA18706
anti-ZO1 Invitrogen 402200
IRDye 800W LI-COR Inc 925-32210
IRDye 680 LI-COR Inc 926-32223
anti-mouse AlexaFluor 647 Thermo Fisher A211241
anti-rabbit AlexaFluor 647 Thermo Fisher ab150075
Halt Protease and Phosphatesse Inhibitor Thermo Fisher 1861281
Precision Plus Protein Dual Color Bio-Rad Laboratories Inc 161-0374
Partec CellTrics Sysmex 04-004-2326 30 μm filter for flow
GAPDH-F IDT AGCCACATCGCTCAGACAC
GAPDH-R IDT GCCCAATACGACCAAATCC
Ecadherin-F IDT TGGAGGAATTCTTGCTTTGC
Ecadherin-R IDT CGCTCTCCTCCGAAGAAAC
ZEB1-F IDT GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC
ZEB1-R IDT CGATTACACCCAGACTGC
NOTCH-F IDT GGCAATCCGAGGACTATGAG
NOTCH-R IDT CTCAGAACGCACTCGTTGAT
nitro blue tetrazolium  Sigma N5514
hexadimethrine bromide Sigma H9268 polybrene
3 mL syringe BD Bioscience 309657
Sterile syringe filter VWR 28145-505
5mL polypropylene round-bottom tube 352063 flow cytometry tubes
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher 4368814 reverse transcription kit
4% paraformaldyhyde Santa Cruz Biotechnology sc-281612
Triton-X100 Sigma 93443
bovine serum albumin Sigma A7906

Referenzen

  1. Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).
  2. Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm. Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).
  3. Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. The role of EMT in renal fibrosis. Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).
  4. Willis, B. C., Borok, Z. TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).
  5. Ye, X., Weinberg, R. A. Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression. Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).
  6. Li, L., Li, W. Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation. Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).
  7. Tsai, J. H., Yang, J. Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis. Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).
  8. Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).
  9. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).
  10. Mathow, D., et al. Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism. EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).
  11. Ware, K. E., et al. A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop. Oncogenesis. 2, e39 (2013).
  12. Yauch, R. L., et al. Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).
  13. Jolly, M. K., et al. Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness. J R Soc Interface. 11 (101), 20140962 (2014).
  14. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
  15. Chen, L., et al. Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression. Nat Commun. 5, 5241 (2014).
  16. Nicolazzo, C., Gradilone, A. Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma. Anal Cell Pathol (Amst). , 697395 (2015).
  17. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2. Mol Cell Biol. , (2016).
  18. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer. J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  19. Humphries, B., Yang, C. The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy. Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).
  20. Renner, M., et al. MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas. Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).
  21. Petrof, G., et al. Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome. Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).
  22. Werner, S., et al. Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer. J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).
  23. Werth, M., et al. The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex. Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).
  24. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2. Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).
  25. Varma, S., et al. The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation. J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).
  26. Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry. Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).
  27. Zhao, Z., et al. A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation. Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).
  28. Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. (92), e51998 (2014).
  29. Yang, J., et al. Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug. Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).
  30. Alba-Castellon, L., et al. Snail1 expression is required for sarcomagenesis. Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).
  31. Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells. PLoS One. 11 (6), e0156904 (2016).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Ware, K. E., Gilja, S., Xu, S., Shetler, S., Jolly, M. K., Wang, X., Bartholf Dewitt, S., Hish, A. J., Jordan, S., Eward, W., Levine, H., Armstrong, A. J., Somarelli, J. A. Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. J. Vis. Exp. (122), e55520, doi:10.3791/55520 (2017).

View Video