Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

1. Sortierung von kleinen Molekül-Kinase-Inhibitor-Bibliotheken Sortierung von Inhibitorbibliotheken aus öffentlich zugänglichen Kinase-Inhibitor-Sammlungen, zB Library of Integrated Network-based Cellular Signatures (LINCS) von der Harvard Medical School, eine gezielte Sammlung von 228 potenten und selektiven Kinase-Inhibitoren (http://lincs.hms.harvard.edu) , Und das Protein-Kinase-Inhibitor-Set (PKIS), eine 376 zusammengesetzte Sammlung, die von Industrieforschern zusammengestellt wurde (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . Alternativ können Sie eine maßgeschneiderte Kinase-Inhibitor-Kollektion aus handelsüblichen Verbindungen zusammensetzen. HINWEIS: In unserem Labor haben wir eine Sammlung von 72 potenten und selektiven Werkzeugkinase-Inhibitoren zusammengestellt, die 51 primäre Zielkinasen abdecken, die alle aus kommerziellen Quellen verfügbar sind. Zusammensetzen von Kinase-Inhibitoren in 96-Well-Platten für eine optimale Hochdurchsatzverarbeitung bei mehreren Konzentrationen (Einsatz 1, 0,1 aNd 0,01 mM). In jede Plattenkontakt-Vertiefungen, die nur DMSO enthalten, und Referenzkontrollinhibitoren PD173074 (FGFRi) und Ruxolitinib (JAKi), die bekanntermaßen naive und grundierte pluripotenten Zustände fördern, enthalten sind. Annotieren Sie in einer Tabellenkalkulation oder einer ähnlichen Software. 2. mESC-Kulturbedingungen und -verfahren für die Screen-Vorbereitung 0,1 g-Gelatine-beschichtete 10-cm-Schalen zugeben, indem man 5 ml 0,1% (w / v) Gelatine zu 10 cm-Platten hinzufügt und bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert. Gelatine anziehen und 2 Minuten trocknen lassen. Kultur jeder Standard-MESC-Linie bei 37 ° C 5% CO 2 auf 0,1% mit Gelatine beschichteten 10 cm-Schalen in Standard-MESC-Medien (siehe Materialtabelle ) mit 100 ng / mL GST-LIF, 10% Fetal-Kalbs Serum und 5% Knockout Serum Ersatz. Ersetzen Sie Medien jeden Tag und Durchgang mESCs bei etwa 80% Konfluenz jeden zweiten Tag bei einer Verdünnung von 1: 5-1: 10. Zum Durchgang von MESCs, Absaugen von Medien und Waschen mit 5 ml OF Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pro Platte. Füge 1 ml Trypsin-EDTA (0,05% Trypsin, 0,02% EDTA) pro Platte von mESCs hinzu und inkubiere bei 37 ° C für 10 min. Restenzen Sie die trypsinisierten Zellen in 4 ml mESC-Medien und zentrifugieren Sie bei 1200 U / min für 5 min. Das Pellet in 5 ml MESC-Medien sorgfältig resuspendieren, nach oben und unten pipettieren, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen. Zählzellen durch Kombinieren einer 10 & mgr; l Zellsuspension und 10 & mgr; l Trypan Blue (0,4%). In eine Zellzählkammer stellen oder ein Hämocytometer und Lichtmikroskop verwenden. Samen 3 x 10 3 mESCs in 0,1% gelatinebeschichtete 96-Well-Platten, Endvolumen 100 μl Medium, unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. Die Kinase-Inhibitoren bei 1: 100 Verdünnung (1 & mgr; l Inhibitor zu 100 & mgr; l Medium) unter Verwendung einer Mehrkanalpipette auftragen. Sanftes Pipettieren von Medikamenten, um Inhibitor und Zellsuspension zu mischen, dann lassen sich die Zellen in einer Gewebekulturhaube für 1 h absetzen, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleistenSs die Überzugsfläche. Kulturzellen für 48 Stunden ohne Medienwechsel. HINWEIS: Stammplatten von 1 / 0,1 / 0,01 mM ergeben eine endgültige Inhibitorkonzentration von 10/1 / 0,1 μM. Empfiehlt es sich, den Bildschirm bei einer Endkonzentration von 1 μM zu starten, um eine wirksame Hemmung der primären Zielkinasen zu gewährleisten und gleichzeitig die Off-Target-Effekte zu minimieren. 3. Kinase Inhibitor Screening Analyse Waschen Sie 96 gut mESC Platten in 200 μL PBS mit Mehrkanal-Aspirator und Pipetten. Zellextrakte in 150 μl Lysepuffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 (v / v), 0,5% Natriumdeoxycholat (w / v), 10 mM β-Glycerophosphat , 10 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4 , komplette Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten). Klären Sie die Extrakte durch Zentrifugation bei 1.500 xg für 30 min in V-Boden-96-Well-Platten. 100 μl Überstände auf ein Nitrocel immobilisierenLymphmembran unter Verwendung eines 96-Well-Vakuum-Punkt-Blot-Verteilers. Trocknen Sie die Membran und Fleck mit 40 ml Ponceau S, um eine gleichmäßige Übertragung zu gewährleisten. Waschmembran mit TBST und Block in TBST / 3% (w / v) Milch. Inkubieren in Nanog- und Dnmt3b-Antikörpern bei einer Verdünnung von 1: 1000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) Milchpulver über Nacht. Waschmembranen in 3 x 10 min in TBST waschen und in 30 ml Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1: 10.000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) Milch inkubieren. Entwickeln Sie mit einem digitalen Immunoblotting-Imaging-System. HINWEIS: Wenn möglich, verwenden Sie quantitative Fluoreszenz-Immunoblotting, um Nanog und Dnmt3b zu erkennen. Allerdings ist das Hintergrundsignal für Dnmt3b durch Fluoreszenz-Immunoblotting zu hoch. Daher werden 800 nm Fluoreszenz-Anti-Kaninchen (Nanog) und Anti-Maus-HRP (Dnmt3b) sekundäre Antikörper verwendet. 4. Analyse der Screen-Daten und Validierung von Inhibitoren als Bona Fide Pluripotency Regulatoren <p class="jove_content"> HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt, um sicherzustellen, dass nur bona fide Pluripotenzmodulatoren identifiziert werden. Es ist entscheidend für Triage-Inhibitoren, die sowohl auf Nanog: Dnmt3b-Verhältnis als auch auf Gesamtsignal basieren, um sicherzustellen, dass Kinase-Inhibitoren, die das MESC-Überleben negativ beeinflussen, nicht für eine weitere Analyse ausgewählt werden. Quantifizieren Sie Nanog- und Dnmt3b-Signal mit Hilfe von Immunoblotting-Analyse-Software und importieren Sie Werte in eine Tabellenkalkulation oder ähnliche Software. Berechnen Sie das Nanog: Dnmt3b-Verhältnis für alle Proben im Vergleich zur DMSO-Kontrolle. Außerdem bestimmen Sie das gesamte Nanog- und das Dnmt3b-Signal, um sicherzustellen, dass Kinase-Inhibitoren das Nanog: Dnmt3b-Verhältnis nicht beeinflussen, indem sie die Lebensdauer von mESC verändern. Verwenden Sie Ranglisten-Nanog: Dnmt3b-Verhältnisse, um Inhibitoren zu identifizieren, die naive Pluripotenz fördern (Nanog: Dnmt3b-Verhältnis höher als Kontrolle) und grundierte Pluripotenz (Nanog: Dnmt3b-Verhältnis niedriger als Kontrolle). Setzen Sie den Cut-off bei 2x Abweichung von den Steuerwerten und filtern Sie Kinase-Inhibitoren aus, die ein Gesamt-Nanog + Dnmt3b-Signal erzeugen50% des DMSO-Kontrollwertes, um eine hohe Vertrauensliste von Kinase-Inhibitoren zu erzeugen, die das naive (hohe Nanog: Dnmt3b-Verhältnis) und das geplante (niedrige Nanog: Dnmt3b-Verhältnis) pluripotenten Zustände stabilisieren. Validieren von Kinase-Inhibitoren durch Samen von mESCs bei 2 x 10 5 Zellen pro 6-Well in 2-ml-Medien und Zugabe von Kinase-Inhibitoren bei 1 μM für 48 h, ohne Medienwechsel. Lyse mESCs in Lysepuffer und analysieren Nanog- und Dnmt3b-Expression durch konventionelles SDS-PAGE-Immunoblotting. Weiterhin validieren Sie Treffer durch SDS-PAGE-Immunoblotting für naive Pluripotenzmarker Klf2 und Klf4 und Oct4, um sicherzustellen, dass die Pluripotenz nach 48 h Inhibitorbehandlung aufrechterhalten wird.