طريقة بسيطة لتحديد الحركات التي تنظم تعدد القدرات الجذعية للخلايا الجذعية من خلال فحص المانع عالي الإنتاجية
Summary
هنا، نقدم بروتوكول الكمي وقابلة للتنفيذ لأداء شاشات جزيئات صغيرة المستهدفة للمنظمين كيناز للتحول متعدد القدرات السذاجة تستعد.
Abstract
الخلايا الجذعية الجنينية (إيسس) يمكن تجديد الذات أو التفريق في جميع أنواع الخلايا، وهي ظاهرة تعرف باسم تعدد القدرات. وقد وصفت دول متعددة القدرات، وصفت بأنها "ساذجة" و "مستعدة" تعدد القدرات. إن الآليات التي تتحكم في الانتقال الساذج غير مفهومة. على وجه الخصوص، ونحن لا تزال غير مدركين جيدا عن كينازات البروتين التي تحدد الدول المحفزة السذاجة وتستعد، على الرغم من زيادة توافر مركبات أداة ذات جودة عالية للتحقيق وظيفة كيناز. هنا، نحن تصف منصة قابلة للإنجاز المستهدفة شاشات جزيء صغير للمنظمين كيناز للتحول متعدد القدرات السذاجة تستعد في المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس. يستخدم هذا النهج ظروف زراعة الخلايا البسيطة والكواشف القياسية والمواد والمعدات للكشف والتحقق من مثبطات كيناز مع آثار غير مقدر حتى الآن على تعدد القدرات. نناقش التطبيقات المحتملة لهذه التكنولوجيا، بما في ذلك فحص جزيء صغير آخرمجموعات مثل مثبطات كيناز المتطورة على نحو متزايد والمكتبات الناشئة من المركبات أداة جينية.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية (إيسس) لديها القدرة على التجديد الذاتي أو التفريق في أي نوع من الخلايا في الجسم الكبار، وهي ظاهرة تعرف باسم تعدد القدرات 1 . وتشير الدلائل الأخيرة إلى وجود دول متعددة القدرات تنمويا، يطلق عليها "تعدد السذاجة" و "المفترضة". تمثل المجالس الاقتصادية والاجتماعية الساذجة حالة من التطور مماثلة لتلك الموجودة في الجنين قبل الزرع 3 . وعلى النقيض من ذلك، تستعد المجالس الاقتصادية والاجتماعية المحفزة المتعددة القدرات للخروج من تعدد القدرات والتمييز في الأنساب الجنينية المتخصصة 4 ، 5 .
وتتميز الدول المحفزة الساذجة والمستعدة بشبكات تنظيمية جينية متميزة. يتميز تعدد القدرات السذاجة بالتعبير عن عوامل النسخ متعددة القدرات الرئيسية مثل عوامل النسخ النانوج، مثل كروبل (كلفس)، Rex1 2 و إسرب <supكلاس = "كريف"> 6. في المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس (ميسس)، يتميز تعدد القدرات تستعد بتقليص التعبير عن علامات ساذجة والتوقيع التعبير الجيني المحدد الذي يتضمن دي نوفو الحمض النووي ميثيل ترانسفيراس Dnmt3b 7 . في الجسم الحي ، تستعد متعدد القدرات بعد زرع الخلايا الجذعية إبيبلاست (إبيسس) 4 ، 5 بالإضافة إلى التعبير عن علامة إبيبلاست Fgf5 وعلامات النسب فتيلة مثل براشيوري 8 .
تقدم ميسس نموذجا قابل للسحب لتحقيق الآليات التي تتحكم في التحولات متعددة السذاجة مستعدة في المختبر . عندما مثقف في سرطان الدم عامل مثبط (ليف) ومصل البقري الجنين (فبس)، ميسس تمر الانتقال الديناميكي بين الدول المحفزة السذاجة وتستعد 9 ، 10 . ليف-جاك-Stat3 وظائف الإشارات لتعزيز شبكة تنظيمية الجينات ساذجة 11 </سوب>، في حين أن التشوير الأوتوقراطي عبر عامل نمو الخلايا الليفية 4 (Fgf4) Erk1 / 2 مسار يدفع الانتقال إلى الدولة معدة 12 . ومع ذلك، لا يزال من الصعب إجراء تقييم منهجي لدور الكينازات البروتينية في تحديد حالات متعددة القدرات.
هنا، وصفنا منصة كمية وقابلة للتطوير من خلالها لأداء شاشات جزيئات صغيرة المستهدفة للمنظمين كيناز للتحول المحفزة السذاجة تستعد. نحن نستخدم ظروف ثقافة ميسك بسيطة والكواشف القياسية والمواد والمعدات للكشف والتحقق من مثبطات كيناز مع القدرة غير المقدرة حتى الآن لتحقيق الاستقرار في تعدد القدرات الساذجة. وعلاوة على ذلك، نناقش التطبيقات المحتملة المحتملة لهذه التكنولوجيا، بما في ذلك لفحص مجموعات جزيئات صغيرة أخرى مثل المكتبات المانع الناشئة التي تستهدف المنظمين جينية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهنا نبرهن على منهجية يمكن الوصول إليها على نطاق واسع للتحقيق في دور مسارات إشارات كيناز في تنظيم الانتقال المتعدد القدرات الساذج. هذا يعالج سؤالا رئيسيا في مجال إيسك. على الرغم من أن الجينوميات الإنتاجية العالية والنهج ترانسكريبتوميكس تستخدم بشكل روتيني لتحديد المنظمين النسخي الرئيسية من الدول المحفزة السذاجة والمعدية، وقد أثبتت توضيح شبكات الإشارات متعددة القدرات أن يكون تحديا. ونحن نقدم الآن استراتيجية مرنة تستخدم مثبطات كيميائية لتحديد الكينازات التي تتحكم في التحول متعدد القدرات الساذج في ميسس. هذا يعتمد على معدات بسيطة، الكواشف والمواد التي تتوفر لمعظم المختبرات التي تدرس الإشارات الخلية و إيسك البيولوجيا. من الأمور الحاسمة لنجاح هذا المنبر هو تطوير لدينا مقايسة قوية لتحديد الانتقال بين الدول المحفزة السذاجة وتستعد. إنشاء هذا الفحص يتطلب تعديلات تكرارية كبيرة ل بلات الخليةالكثافة، وقت حضانة المانع وظروف إمونوبلوتينغ.
نهج جزيء صغير تكتسب الجر للاستخدام الرشيد في تطبيقات إيسك العلاجية 15 ، 16 . وتتمثل القوة الرئيسية لفحص الجزيئات الصغيرة في تصميم مركبات الأدوات و / أو تعديلها من أجل امتصاص الخلايا الخلوية الفعال. كفاءة ترنسفكأيشن لا يحد، واستخدام أنظمة التوصيل الخطرة مثل لنتيفيروس ليست ضرورية. وعلاوة على ذلك، مثبطات كثيرا ما تمنع العديد من الأشكال الإسوية داخل عائلة كيناز (على سبيل المثال Fgfr1-4، Jak1-3)، الذي يتغلب على التكرار الوظيفي الذي يعوق تقنيات التدخل الجينية / الجينومية مثل رناي و كريسبر / Cas9. وكلما أصبحت مركبات الأدوات الأكثر فعالية وانتقائية متاحة من البرامج الأكاديمية واكتشاف الأدوية الصيدلانية، سيتم دفع الكينازات المفهومة وغير المفهومة إلى مقدمة البحوث الاقتصادية والاجتماعية والثقافية. لذلك نقترح أن هذا عاليةسوف تفحص نهج فرز الخام فتح آفاق جديدة للبحث في الشبكات التنظيمية الأساسية إيسك.
أحد القيود البسيطة لهذه التكنولوجيا هو أن حتى أقوى ومثبطات جزيئات صغيرة انتقائية إشراك وتمنع العديد من كيناسس غير ذات صلة في الجسم الحي . ومع ذلك، على نحو متزايد شاملة كيناز بيانات المانع التنميط يسمح أهداف وظيفية من مثبطات كيناز التي يمكن التعرف عليها بسهولة (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan؛ http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibitors). وأخيرا، من حيث المبدأ لدينا منصة يمكن تطبيقها على استجواب أي جزيء صغير جمع و / أو فحص الخلوي التي هي ذات جودة عالية الأجسام المضادة إمونوبلوتينغ المتاحة. وهذا سوف يسمح بدراسة نظم تنظيمية متعددة في تنظيم تعدد القدرات وتسهيل تحديد مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تعدل العمليات الخلوية المتنوعة. على وجه التحديد، ونحن نتصور أن تطبيق مجموعات جزيء صغيرة الناشئة مثل إبيجينتحقيقات تيك التي يجري تطويرها من قبل اتحاد الجينوميات الهيكلية (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) لديه القدرة على كشف المزيد من منظمي جديدة للتحولات متعددة القدرات.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم كاسو من قبل مجلس البحوث الطبية طلبة الدكتوراه. ويدعم غمف جزئيا من قبل مجلس البحوث الطبية جائزة المحقق الجديد (مر / N000609 / 1) ومنحة البحوث تينوفوس اسكتلندا.
Materials
| mESC media | |||
| CCE mESCs | ATCC | ATCC SCRC-1023 | |
| DMEM Media | Gibco | 11965092 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Final: 2mM |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Final: 50U/ml |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Final: 0.1mM |
| Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion) | MRC-PPU reagents and services | Final: 100ng/ml | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo | PMC9484 | Final: 100ng/ml |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | Final: 0.1mM |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | Final: 1mM |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Final: 5% |
| Defined Fetal Bovine Serum | Fisher | 10703464 | Final: 10% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TC materials | |||
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo | 25300054 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 1890 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo | 156545 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190136 | |
| V-bottom 96 well plates | Greiner Bio-one | 651261 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis Buffer | |||
| Tris buffer | VWR | 103157P | |
| Sodium Chloride | VWR | 97061 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| 1% NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-100g | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Sodium Pyrophosphate | Sigma | 13472-36-1 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | 450022 | |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Sigma | CO-RO | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Tween | Sigma | P1379-1L | |
| Milk Powder | Marvel | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Western Blotting | |||
| Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45uM Pore size (20 X 20cm Sheets) (25 Sheet) | GE | 10401191 | |
| Ponceau S | Sigma | P7170-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory Equipment | |||
| Minifold I System | GE | 10447850 | |
| ChemiDoc imager | BioRad | 1708280 | |
| LiCor Odyssey Imager | LiCor | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Nanog | Reprocell | RCAB001P | |
| Anti-Dnmt3b | Imgenex | IMG-184A | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit | Licor | 926-32213 | |
| Anti-mouse-HRP | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| Anti-Klf2 | Millipore | 09-820 | |
| Anti-Klf4 | R&D Systems | AF3158 | |
| Anti-Oct4 | Santa Cruz | sc-5279 |
Referenzen
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
- Boroviak, T., et al. Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis. Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).
- Tesar, P. J., et al. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).
- Brons, I. G. M., et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).
- Festuccia, N., et al. Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells. Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).
- Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
- Guo, G., et al. Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency. Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).
- Chambers, I., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
- Findlay, G. M., et al. Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate. Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).
- Elkins, J. M., et al. Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set. Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).
- Williams, C. A. C., et al. Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity. Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), (2016).
- Zhang, M., et al. Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation. Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).
