In Vitro und In Vivo Beurteilung der T, B und myeloische Zellen Suppressive Aktivität und humorale Reaktionen von Transplantationspatienten

Cardiac Allograft in Ratte ist ein zuverlässiger Organ Transplantation Modell zur Bewertung der Toleranz-Induktion-Behandlungen, um die Mechanismen der Toleranzinduktion und Wartung, zu entschlüsseln und hat das Potenzial, funktionell zuständigen und dominante regulatorische Zellen induzieren. Die folgenden Protokolle beschreiben eine voll Missverhältnis heterotopisch kardiale Transplantat von Lewis 1W Spender Ratte (LEW.1W, RT1^u) in eine Lewis 1A Empfänger Ratte (LEW.1A, RT1^ein). In dieser Kombination Transplantat akuten Abstoßung tritt schnell (in ca. 7 Tage) und von Graft schlagen Messung durch Abtasten des Bauches leicht beurteilt werden kann. Hier schlagen wir drei Protokolle, um die Toleranz gegenüber der cardiac Allograft in Ratte zu induzieren. In diesen Modellen ist Toleranz induzierte bzw. von verschiedenen regulatorischen Zelltypen gepflegt. Erstens die Blockierung des CD40-CD40L Interaktionen mit einer Codierung CD40Ig Adenovirus (AdCD40Ig) induziert die Generation der CD8⁺ Tregs fähig induzierende Toleranz bei adoptively auf sekundäre veredelte Empfänger¹übertragen. Darüber hinaus Erschöpfung der CD8⁺ Zellen (mit Anti-CD8α Antikörper) in AdCD40Ig behandelt Empfänger erzeugt Bregs und RegMCs². Tiefenanalyse der CD8⁺ Tregs Eigenschaften die Schlüsselrolle der mehrere immunregulatorische Moleküle definiert als Interleukin-34 (IL-34) und Fibroleukin-2 (FGL-2)^{3,4,5,6 hervorgehoben} . Während Überexpression des IL-34 (mit AAV-Vektor) Tregs durch Generierung von RegMCs induziert, induzierte Überexpression des FGL-2 Bregs, das komplexe Netzwerk von regulatorischen Zellen zugrunde.

Da chronische Ablehnung entwickelt sich langsam und langfristig ist, ist eine eingehende Analyse erforderlich, um Toleranz gegen chronische Ablehnung zu unterscheiden. Transplantat bemisst sich in der Regel für Zelle Infiltration, Fibrose, Verdickung der vaskulären Wand und Ergänzung C4d-Abscheidung von Immunhistologie⁷. Während Histologie Methoden Tieropfer erfordern oder Biopsie-Transplantat, hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Bestimmung der unterschiedlichen Merkmale der tolerierten Allograft: die Entstehung und Funktion der regulatorischen Zellen und die spezifischen Antikörper Anti-Spender-Antworten aus Blut Probe durch Durchflusszytometrie (Wir verwendeten hier, Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS)).

Wartung der Toleranz gegenüber der Allograft nach Verhaftung der Behandlung ist in der Regel verbunden mit der Induktion von regulatorischen Zellen⁸. In den letzten Jahrzehnten Studien konzentrierten sich auf CD4⁺Tregs einstimmig charakterisiert sie durch die wichtigsten Marker Foxp3⁺, CD25^hochund CD127^–9,10,11. In ähnlicher Weise mehrere Markierungen wurden CD8 zugeschrieben⁺ Tregs, wie CD122⁺, CD28^–, CD45RC^niedrig, PD1⁺, und Helios^{+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17}. im Laufe der Jahre Ausdruck von GITR, CTLA4 und Zytokine (IL-10, IL-35, TGFβ, IL-34 FGL-2) wurden zusätzlich mit einem Treg Profil^{3,4,6,13, verbunden 18,19,20,21}. Aufstrebenden regulatorischen Zell-Populationen, z. B. Bregs, RegMCs oder NKTregs, fehlen aber entsprechende spezifische Marker. In der Tat, Bregs sind meist als Unreife CD24 berichtet⁺ Zellen mit zweideutigen CD27 Ausdruck und manchmal Produktion von IL-10 und TGFβ Granzym B^22,23,24. Die Komplexität der myeloischen Zellen Linie erfordert eine Kombination von mehreren Marker definieren ihre behördlichen oder proinflammatorischen Profil z. B. CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a oder CD163^25,26. Zu guter Letzt einige Marker gemeldet wurden, um NKTregs wie CD11b zu identifizieren⁺, CD27⁺, TGFβ⁺, aber weitere Studien sind erforderlich, um weitere phänotypisch^{27,28,29 beschreiben ,30,31,32}. So Beweise suppressive Aktivität sind erforderlich, um weiteren phänotypischen Beschreibung für die Identifizierung neuer Biomarker, legitimieren neue immunregulatorische Vermittler und Ausweitung des Anwendungsbereichs auf neue Zelltherapien.

Wir schlagen zwei komplementäre Methoden um die suppressive Aktivität der Zellen zu bewerten. Erstens die in-vitro- Methode besteht darin, unterdrückende Zellen mit beschrifteten T-Effektorzellen angeregt durch allogene Spender antigenpräsentierende Zellen (APCs) bei unterschiedlichen Verhältnissen in 6 Tagen Kultivierung und Analyse der Effektor T Zell-Proliferation, unter der Regie von Spender Immunsuppression widerspiegelt. Zellen von behandelten Ratten können direkt mit Zellen von naiven Ratten und unbehandelten veredelte Ratten für suppressive Aktivität (oder andere regulatorische Zell-Population), in einer Reihe von Suppressor: Effektor Verhältnisse verglichen werden. Darüber hinaus diese Methode erfordert kein Transplantation, und Ergebnisse sind innerhalb von 6 Tagen. Zweitens besteht die in-Vivo -Methode die beabsichtigten regulatorischen Zellen von einer behandelten Ratte an einen neu bestrahlten veredelte Empfänger übertragen. Während B-Zellen, myeloische Zellen oder T-Zellen aus unbehandelten naiv Ratten sind in der Regel nicht in der Lage, akuten Abstoßung zu hemmen und Transplantat-Überleben bei Adoptiveltern Übertragung zu verlängern, Zellen mit potenzierten suppressive Aktivität von behandelt-Empfänger haben diese Attribute ^1,2,3,4,33. Lymphopenie induziert durch Bestrahlung des Empfängers wird empfohlen, adoptively übertragene Zellen, Blut Homöostase unberührt und die Anti-Spender-Immunantworten leichter meistern können. Für beide Methoden, die in-vitro- Nutzung der allogenen APCs oder in Vivo Adoptiv Übertragung von suppressive Dritter ermöglichen Zellen zu Empfängern veredelt mit einem Drittanbieter-Herzen Analyse der Spezifität Anti-Spender. Die in-Vivo -Methode erfordert eine beträchtliche Anzahl von Zellen, schlecht vertreten können Zelle Subpopulationen leichter suppressive Aktivität in Vitro³³bewertet werden.

Humorale Reaktionen können auch gemessen werden, um den Zustand der Toleranz und der Kontrolle der gerichtete Antikörperreaktionen auf Spender Antigene zu beurteilen. In der Tat kann Toleranz keine humorale Antwort in Richtung der Spender aber Erhaltung der Kapazität für die Empfänger, humorale Antwort auf neue Antigene entwickeln und Bewahrung der Erinnerung Reaktionen charakterisiert werden. Erstens basiert das Prinzip der Alloantibody-Erkennung auf Anerkennung der Spenderzellen durch Empfänger Antikörper nach Inkubation der Spender Zelltyp mit Serum von einem veredelten Empfänger. Zweite, humorale Reaktionen auf exogene Antigene gerichtet können bewertet folgende Stimulation der langfristigen tolerant Empfänger mit Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) mit kompletten Freund der adjuvanten emulgiert werden. Das Vorhandensein von IgM und IgG Antikörper gegen Antigene kann 4 und 13 Tage, bzw. nach Immunisierung mit Enzym verknüpften Immunosorbentprobe Assay (ELISA)³⁴nachgewiesen werden. Drittens kann die Erhaltung des Immunsystems Speicher Antworten am Tage-7 und + 3 Transplantation und Erythrozyten Färbung mit Empfänger Serum am Tage gesammelt + 8 und + 17 nach Transplantation durch Injektion von xenogene roten Blutkörperchen (Erythrozyten) beurteilt werden. Alle diese Methoden erlauben die Identifizierung von Immunglobulin-Subtypen mit spezifischen Sekundärantikörper und schnelle Erfassung der Ergebnisse in weniger als 1,5 h von FACS Färbung oder ein paar Stunden von ELISA.

Schließlich diese Protokolle sind für die Charakterisierung der Transplantation Modelle konzipiert und können in gewisser Hinsicht auf Autoimmunerkrankung Modelle angewendet. Die Prinzipien der Methode können auf alle Arten umgesetzt werden.