Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of <em>In Vitro</em> Cell Cultures

Andrew Baxter; Emmanuel Minet

doi:10.3791/55502

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Biochemie

La espectrometría de masa y enfoques basados en luminogénico para caracterizar la fase I metabólico de Competencia<em> In Vitro</em> Cultivos Celulares

Published: March 28, 2017

doi:

10.3791/55502

Andrew Baxter¹, Emmanuel Minet¹

¹Research and Development,British American Tobacco

Summary

Competencia metabólica de los sistemas in vitro es un requisito clave para la biotransformación y la disposición de fármacos y sustancias tóxicas. En este protocolo, se describe la aplicación de sondas metabólicos de referencia para evaluar la fase I metabolismo en cultivos celulares.

Abstract

enzimas que metabolizan xenobióticos desempeñan una función clave en la biotransformación de los medicamentos y sustancias tóxicas mediante la adición de grupos funcionales que aumentan la solubilidad y facilitan la excreción. En algunas ocasiones, estas modificaciones estructurales conducen a la formación de nuevos productos tóxicos. A fin de reducir los ensayos con animales, riesgo químico puede evaluarse utilizando células metabólicamente competentes. La expresión de enzimas metabólicas, sin embargo, no es estable con el tiempo en muchos en sistemas de cultivo primario in vitro y es a menudo parcial o ausente en líneas celulares. Por lo tanto, el estudio de medicamentos, aditivos, y el metabolismo de los contaminantes ambientales en vitro idealmente debe llevarse a cabo en sistemas de células en donde la actividad metabólica se ha caracterizado. A continuación explicamos un método para medir la actividad de una clase de enzimas metabólicas (fase I en humanos) en líneas celulares en 2D y 3D culturas primarias usando sondas químicas y sus productos metabólicos cuantificables mediante espectrometría de masas y UPLCluminometrıa. El método puede ser implementado para probar la actividad metabólica en líneas celulares y células primarias derivadas de una variedad de tejidos.

Introduction

Metabolismo de xenobióticos es el proceso a través del cual las sustancias químicas extrañas al organismo son modificados por la adición de grupos hidrófilos y conjugados para facilitar su excreción ^1. Típicamente, el metabolismo de xenobióticos es un proceso de dos pasos con la Fase I consiste principalmente de una oxidación con la adición de uno o múltiples grupos hidroxilo ^{^1,} ^2. En la Fase II, los grupos hidroxilo se utilizan como aceptores para un conjugado hidrófilo tal como glucurónido o un resto sulfato de ^{^1,} ^2. Si un grupo aceptor ya está presente en las moléculas, la etapa de conjugación puede ocurrir independientemente del metabolismo de fase I. Cada reacción se lleva a cabo por un grupo específico de enzimas, por ejemplo, APP (citocromos P450), que catalizan la hidroxilación (Figura 1) y desalquilación de sustratos químicos ^3. Conjugation es catalizada por sulfotransferasas, UDP-glucuronosiltransferasas (Figura 1), glutatión-S-transferasas y N-acetiltransferasas ^4. Cada tejido y órgano tendrán un perfil específico expresión de la enzima metabólica, con el hígado que expresan la mayoría de esas proteínas.

Figura 1: Ejemplo de Fase I y Fase II Metabolismo de cumarina. CYP2A6 / CYP2A13 catalizar la 7-hidroxilación de cumarina. 7-hidroxicumarina se conjuga con un resto glucurónido por enzimas de fase II UGTs, con UGT1A6 y UGT1A9 que muestra la actividad más alta.

La comprensión del metabolismo de xenobióticos es fundamental en la evaluación de seguridad de los medicamentos y para la evaluación de riesgo químico por dos razones: la cinética de reacción se determinará cuánto tiempo un fármaco o producto químico permanecerán en el cuerpo en una forma activa o inactiva bexcreción ntes; y el compuesto de origen se puede modificar para una especie más reactiva, inestable y tóxico por las enzimas metabólicas. Tales reacciones también conocidos como "bioactivación" son impulsados en su mayoría por la fase I CYP enzimas, sino también en ocasiones más raras de fase II conjugación ^5.

Basado en esto, la capacidad de un modelo in vitro para predecir con precisión el riesgo asociado con un fármaco o una sustancia química depende de la competencia metabólica del sistema celular altamente. Las líneas celulares derivadas de tejidos enfermos o de transformación de células normales a menudo pierden parte si no la totalidad del perfil de enzima metabólica representante de su tejido de origen ^6. El mantenimiento del perfil de la enzima metabólica normal aparece mejor en cultivos celulares primarios (al menos en cultivos de corto plazo) y se mejora aún más si el tejido se cultiva en una matriz que le permite conservar su estructura 3D ^1. Por lo tanto, el carbón de leñaacterization de la competencia metabólica de un sistema de células in vitro es un paso preliminar importante en la orientación de la decisión sobre qué modelo de células es apropiado para llevar a cabo evaluaciones de seguridad química.

En este documento se presenta un protocolo para el perfil de la actividad y expresión de enzimas de fase I CYP in vitro con ejemplos de su aplicación con una línea celular hepática ⁷ y cultivos celulares primarios de pulmón 3D ^8. sustratos específicos de CYP, sus productos metabólicos y el inhibidor de controles se describen junto con spectrometry- de masas y métodos de cuantificación basados en luminógeno. Dado que algunos APP son inducibles y otros son constitutivos, también se dan ejemplos para los dos escenarios.

Protocol

NOTA: El flujo de trabajo general para el ensayo de la actividad metabólica se describe en la Figura 2. Cada paso de este flujo de trabajo es posteriormente detallada en los siguientes párrafos. Tablas detalladas de reactivos y equipos se dan en la Tabla de Materiales. Figura 2: Flujo de trabajo para el ensayo de sondas metabólico. Las células se siembran y crecen a la densidad adecuada. Un paso de inducción CYP podría ser necesario dependiendo de la actividad de la enzima se ensayó. El sustrato sonda y el inhibidor se añade al cultivo celular. Después de un período de incubación, el medio se recogió para el análisis y las células se lisan para la cuantificación de proteínas. El medio se procesa para el análisis del producto metabólico del sustrato sonda por espectrometría de masas o luminometría.ad / 55502 / 55502fig2large.jpg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 1. Cultura celular Figura 3: Micrografía de transmisión de luz de una célula hepática línea de cultivo. La línea celular descrita en este protocolo 5 típicamente diferenciar con una fracción de 50% entre cholangiocytes y hepatocitos en cultivo (100x). Barra de escala = 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Cultura línea celular hepática NOTA: Se utilizó una línea celular hepática disponible comercialmente como un ejemplo de células metabólicamente competentes. La línea celular se deriva de un hepatocarcinoma causada por la infección viral 7. En la confluencia, esta línea celular se diferencia en células cholangiocyte- y hepatocito (Figura 3) y más detalles se pueden encontrar en Guillouzo 7. La inclusión de 2% de DMSO al medio de cultivo apoya la diferenciación de esta línea celular y la expresión de una variedad de APP. Retirar los viales criogénicos con células del nitrógeno líquido y colocar en hielo seco para el transporte. Transferir el criovial a un baño de agua precalentado a 37 ° C durante 1-2 min, y esterilizar el exterior del vial con etanol al 70% antes de colocar en una campana de flujo laminar. Mientras que trabaja bajo condiciones estériles, abrir cuidadosamente el vial criogénico para liberar el exceso de presión y pipetear los contenidos del vial criogénico en un tubo de 10 ml lleno con 9 ml de medio E pre-calentado Williams' a 37 ° C. Centrifugar la solución durante 10 min a 400 xg a temperatura ambiente, descartar el sobrenadante, y resuspender las células en 5 ml demedio deshielo patentada pre-calienta a 37 ° C, suplementado con glutamina o un suplemento de glutamina (2 mM de concentración final) (Williams' E + glutamina suplemento + suplementos de descongelación). Recuento de células viables utilizando una alícuota de 500 l con un contador de células o cualquier otra técnica de recuento celular adecuada. Seed las células en una placa recubierta con colágeno de 24 pocillos a una densidad de 0,6 x 10 6 células viables / pocillo en un volumen final de 0,5 ml de medio de descongelación. Colocar la placa (s) en una incubadora a 37 ° C con un 5% / 95% de CO 2 / aire y 100% de humedad relativa. 24 h después de sembrar las células, sustituir el medio con 0,5 ml de medio de trabajo pre-calentado mantenimiento / metabolismo (Williams' E + glutamina suplemento + suplemento metabolismo (este medio ya contiene DMSO)). Cambiar el medio cada dos días. Después de unos pocos días en cultivo las células forman una estructura trabecular sub-confluentes (Figura 3). El metabólica óptimala actividad se observa típicamente entre el día 7 y 10 y es el más bajo en el día 4. Figura 4: Corte transversal de las vías respiratorias células Alcian teñido con azul Grown en la interfase aire-líquido 8. Ciliado, productores de moco y las células basales son claramente visibles. Barra de escala = 250 m. Culturas epitelio de las vías respiratorias diferenciados NOTA: El protocolo se muestra con un epitelio de la vía aérea principal completamente diferenciada disponible comercialmente crecido en la interfase aire-líquido en un inserto 8 (Figura 4). El cultivo de tejido retiene un fenotipo mucociliar y la polaridad celular 8. Las células pueden ser de origen nasal o bronquial. En este caso, utilizar las células nasales humanos. Las células se entregan en un formato de placa de cultivo con 24inserta en la interfase aire-líquido. Para facilitar el transporte y evitar el derrame medio de los insertos se envían con la sección basal incrustado en una matriz de agarosa mezclada con medio de cultivo. A la entrega de las células, esterilizar las placas que contenían los 24 insertos con una solución de etanol al 70% antes de colocar en una campana de flujo laminar limpio. Preparar una placa de 24 pocillos estéril mediante la adición de pre-calentado a 700! L de medio de cultivo de propiedad. Usando pinzas estériles transfieren los insertos de células a la nueva placa de pre-cargado con medio desalojando suavemente la inserción de la matriz de agarosa. Colocar la placa (s) en una incubadora a 37 ° C con un 5% / 95% de CO 2 / aire y 100% de humedad relativa. Cada 2 días transfieren los insertos a una nueva placa de 24 pocillos estéril pre-cargado con 700! L cálido medio de cultivo celular de las vías respiratorias propietaria. Evaluar la integridad de los tejidos de las vías respiratorias utilizando métodos, tales como la resistencia transepitelial (TEER), ocilios frecuencia de batido (CBF) usando un microscopio equipado con un sistema de imágenes de vídeo en directo 9. La medida de TEER y CBF se describe en Kuehn 10. 2. CYP Actividad Cuantificación en cultivos celulares NOTA: Como regla general, los disolventes tales como DMSO y metanol pueden usarse para preparar soluciones madre para las diferentes sondas metabólicas e inhibidores presentados en este documento. Sin embargo, se recomienda mantener la concentración final de DMSO en el medio de cultivo a un mínimo (1% o menos) ya que las altas concentraciones pueden inhibir las enzimas metabólicas. Cuando sea posible, también se recomienda el uso de rojo de fenol libre y medio libre de suero durante la incubación con sondas metabólicos desde rojo fenol puede interferir con APP y la actividad de enzima de la Fase II y el componente de suero tal como albúmina puede disminuir la disponibilidad de la sonda. No siempre es posible adherir estrictamente a estas directrices. Por ejemplo, medio de cultivo celular de las vías respiratorias es propietario y contiene rojo de fenol. Línea celular hepática patentada medio metabolismo 7 ya contiene DMSO por encima de 1%, ya que se requiere para que las células adoptan el fenotipo hepatocitos similares. NOTA: Por último, aquí, el término sonda específica / inhibidor se utiliza esta terminología, pero tiene que ser considerado con precaución. De hecho, es muy raro que una sonda metabólico para ser un sustrato exclusivo enzima. Las sondas descritas aquí, sin embargo, tienen una alta afinidad por su diana enzima y por lo tanto se consideran como marcadores fiables de actividad. Metabólicos sondas, inductores e inhibidores Las sondas utilizando métodos basados en espectrometría de masas NOTA: Las sondas y los inhibidores descritos en esta sección son adecuados para probar la actividad de CYP2As 11, CYP1A2 12,ref "> 13, CYP2B6 7, 14, CYP2F1 15, 16, y CYP2E1 17 por espectrometría de UPLC-masa. Las sondas, inhibidores y CYP correspondientes se describen en la Tabla 1 con las referencias correspondientes. La Tabla 1 también muestra el producto metabólico de la CYP actividad que se cuantifica por espectrometría de masas. todos los trabajos que la cultura y soluciones de tejido para su uso en el cultivo de tejidos se va a llevar a cabo en una campana de cultivo de tejido estéril. una solución madre se puede preparar en DMSO para todos los sustratos de sonda. Antes del experimento preparar dos series de células o pozos, utilizar una serie para el experimento de inhibición, el otro por sólo la sonda metabólico. Preparar una tercera serie de células como un control en blanco medio. Pueden ser en placas separadas o en las mismas placas con un mínimo de tres repeticiones. Un ejemplo de placa yacíafuera se presenta en la Figura 5. En el día del experimento, sustituir el medio de cultivo celular con 450 l de medio fresco. Preparar en una campana estéril una concentración 10x de las siguientes soluciones utilizando el medio de cultivo celular. Mezclar sonda 10x CYP, inhibidor de CYP 10x, y 10x inhibidor de CYP plus 10x sonda. NOTA: Las soluciones Maestro del stock de inhibidor y la sonda se pueden preparar en DMSO al 100% (por ejemplo, 1,000x stocks) y aún más diluidas en medios para obtener una solución 10 veces con el fin de evitar una concentración final de DMSO en exceso de 1% con el cultivo celular . Las concentraciones 1x finales que están destinadas para la incubación con las células se muestran en la Tabla 1. Se filtra la solución diferente 10x sonda con un filtro de jeringa de 0,2 micras. Añadir 50 l de medio que contiene el inhibidor de CYP 10 veces a la serie de células preparadas para el experimento de inhibición y pre-incubar durante 30 min. REColoque el medio de las células en la serie de inhibición con 450! l de medio fresco y añadir 50 l de medio que contiene tanto 10x inhibidor de CYP y el sustrato 10x sonda. Añadir a las otras células 50 l de medio con el sustrato sonda 10x y añadir una cantidad equivalente de vehículo diluido en medio (por ejemplo, DMSO) a los controles de celda en blanco como se muestra en la Figura 5. Se incuban las células durante 0 – 5 min (tiempo 0, el control de fondo) y 16 h en el incubador de células. NOTA: Se utilizó este tiempo de incubación con éxito con las células de las vías respiratorias y la línea de células hepáticas; sin embargo hepatocitos primarios frescas tienen una alta competencia metabólica, en espera de la calidad de la preparación de células y composición genética de donante, por lo tanto, tiempos más cortos (por ejemplo, 2-4 h) podría ser adecuado. Siempre es recomendable llevar a cabo un experimento de curso de tiempo al probar diferentes líneas de células o tipos de células. Al final del periodo de incubación, collect el medio en tubos etiquetados separados para la cuantificación del producto metabólico de las sondas. Congelar el medio para el procesamiento futuro. Lisar las células para la cuantificación de proteínas. NOTA: Cualquier kit de cuantificación de proteína estándar y el protocolo es adecuado para este paso. BCA es una opción adecuada. Este paso es opcional si las células tienen que ser utilizados en otro ensayo. tratamiento medio NOTA: El medio recogido de la etapa de incubación contiene la sustancia química sonda de matriz, así como sus productos metabólicos. Para medir una actividad de CYP específica sólo el producto de la reacción catalizada por la CYP de interés debe ser cuantificada. Fase productos del metabolismo I a menudo se procesan en tándem con el metabolismo de fase II (conjugación) y por lo tanto no pueden ser detectados como tales. Por lo tanto el fin de obtener la cuantificación más precisa de una actividad de CYP, un paso desconjugación se requiere para eliminar cualquierFase II modificación del metabolismo. Desde la conjugación de la Fase I metabolitos a menudo implica la glucuronidación o sulfatación, desconjugación se consigue por tratamiento de las muestras por glucuronidasas y sulfatasas 18. actividad sulfatasa glucuronidasa y es dependiente del pH con la más alta actividad glucuronidasa se logra a un pH de 4,5-5,0 y sulfatasa actividad ser más alta a pH 6,0-6,5. Por lo tanto, este paso requiere ajuste del pH. En el método descrito aquí, se mide el pH utilizando tiras de pH por razones prácticas desde sondas de medidores de pH más no caben en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Disponibles en el mercado tiras de pH se pueden encontrar con una resolución tan bajo como 0,3 a 0,2 unidades de pH. Transferir 250 l de medio de incubación a un microtubo ml 1,5 y añadir 4-metilumbeliferona solución madre de patrón interno para alcanzar una concentración final de 100 nM. Ajustar el pH del medio a 4,5-5,0 mediante la adición de HCl 1 M. Añadir 1 l de HCl a la vez y verificar pHpipeteando 2 l de medio sobre una tira de pH. Llegar a un pH de 5,0 requeriría típicamente no más de 5-10 l de HCl 1 M. Añadir 150 unidades (1,8 l de una unidad de 85.000 / mL de stock) de β-glucuronidasa / arilsulfatasa de Helix pomatia y se incuba durante 1 h a 37 ° C. Detener la reacción mediante la adición de 250 l de metanol frío (-20 ° C). Almacenar las muestras a -20 ° C o proceso adicional. Se evapora el disolvente utilizando una centrífuga de vacío a 45 ° C. Reconstituir las muestras con 500 l de un acetonitrilo 30%: solución de agua. Las muestras están listas para el análisis de espectrometría de masas y se pueden almacenar a -20 ° C en viales de vidrio ámbar. La espectrometría de masa cuantificación basado NOTA: Toda la UPLC y ajustes del espectrómetro de masas se detallan en la Tabla Suplementaria 1 dedicada. Para un análisis cuantitativo, el establecimiento de una curva de calibración se requiere. la calicurva bración se obtiene mediante la ejecución de un conocido intervalo de dilución del compuesto a ser cuantificados. En este caso, las curvas de calibración se generaron más de 10 concentraciones diferentes (Tabla 2), al menos 6 de los cuales debe estar dentro de 20% del rango lineal 19. Menor nivel de detección se determina como la concentración más baja que da una señal mayor que, o igual a 3 veces la señal de fondo promedio. El nivel más bajo de cuantificación se determina como la muestra de la concentración más baja que da una señal mayor, o igual a 10 veces la señal de fondo promedio de ambos de los cuales se determinó durante al menos 3 carreras independientes con muestras triplicadas. Preparar una dilución en serie de un metabolito sintético en el medio de cultivo de tejidos de acuerdo con la Tabla 2, incluyendo el estándar interno. Un volumen final de 250! L por cada dilución estándar es adecuada. Evaporar las diluciones en serie de estándar como se describe en step 2.1.2.4 y resuspender en un volumen de 30% de acetonitrilo: agua equivalente al volumen de los medios de evaporación antes (por ejemplo, 250! l 30% de acetonitrilo: agua si la solución estándar de partida fue 250! l de medio). Añadir 250! L de cada estándar de dilución en serie a un vial de vidrio ámbar UPLC para la inyección en el inyector automático UPLC-MS. Añadir las muestras de ensayo (250 l) a ámbar viales UPLC y colocarlos en el inyector automático UPLC. Selección aleatoria de todos los viales. NOTA: La configuración espectrómetro de masas se utilizó es un espectrómetro de triple cuadrupolo híbrido / lineal de masas de trampa de iones acoplado a un UPLC detallada en la Tabla Suplementaria 1. Otras plataformas tendrían software y configuración diferente, pero deberán seguir unos pasos similares para llevar a cabo la cuantificación. Ejecutar la UPLC-MS utilizando los ajustes que se detallan en la Tabla Suplementaria 1 en función de la sonda específica de cuantificar. Utilizarla "Cuantificar – Construir Método de cuantificación" herramienta en herramientas espectrómetro de masas de cuantificación (Tabla de Materiales) para generar la curva de calibración de la norma sintética adquirida y estándar interno. Utilice la opción "Cuantificación Wizard" para seleccionar la muestra de lotes y muestras para cuantificar y ejecutar el "método de cuantificación". El software espectrómetro de cuantificación de masas muestra una hoja de cálculo con los valores de cuantificación del compuesto objetivo en cada muestra de prueba. Las sondas utilizando métodos basados en luminiscencia NOTA: sondas luminógeno para medir una gama de actividades CYP están disponibles comercialmente; sin embargo, no todos son adecuados para ensayos basados en células. Aquí, un protocolo se presenta para medir la actividad de CYP1A1 / CYP1B1. CYP1A1 / 1B1 fue seleccionado para ilustrar cómo para ensayar la actividad de CYP inducibles y para dar un ejemplo de cómo sondas luminógeno se puede utilizar como un alteroriginaria de los métodos basados en espectrometría de masas. La Tabla 3 resume las concentraciones y el tiempo de incubación se utilizó para las células de las vías respiratorias y la línea celular hepática; sin embargo, aquellos que tenga que ser adaptado para otros tipos de células. Otras sondas luminógenos están disponibles comercialmente y pueden ser utilizados como sustratos para una variedad de APP. Preparar células suficientes para incluir un control no inducido, una prueba de inducido, y un inducido + inhibidor de prueba. Un ejemplo de una disposición de la placa se muestra en la Figura 5B. Para inducir CYP1A1 / 1B1, incubar las células con una concentración final de 10 nM TCDD en un medio durante un periodo de 72 h (períodos más cortos de 24 a 48 h también pueden ser adecuados). PRECAUCIÓN: TCDD es un carcinógeno y teratógeno. Use equipo de protección adecuado, revisar el proveedor MSDS y llevar a cabo una evaluación de riesgos antes de su uso. Después de este periodo, se elimina el medio, lavar los pocillos con PBS 3 veces, y añadir un poco de medio fresco. Prior a la incubación de las células con la sonda indicadora luminógeno, pre-incubar el subconjunto designado de células inducidas por 30 min con una concentración final de 10? M CYP1A1 / 1B1 inhibidor, α-naftoflavona, en medio. Añadir la sonda luminógeno LUC-CEE (luciferina éter 6'-cloroetil) a una concentración final de 50? M a las células no inducidas, inducidas, e inducidos + inhibidor. Incubar durante 4 h en un incubador de cultivo celular. Al final del tiempo de incubación recoger el medio para la cuantificación de la sonda luminógeno. Transferencia de 25 l de medio de cultivo a un blanco opaco placa de 96 pocillos y añadir 25 l de reactivo de detección luciferina suministrado por el fabricante. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Leer la placa inmediatamente usando un luminómetro. Enjuagar las células con PBS y lisar para la cuantificación de proteína total. NOTA: Este paso es opcional si se mantienen las células vivas para futuros experimentos. yot es importante tener en cuenta sin embargo, que los inductores tales como TCDD son tóxicos y pueden dañar las células. Tabla 1: Lista de los productos metabólicos Probes, e inhibidores de la enzima correspondiente con su. El peso molecular y las concentraciones recomendadas utilizados con la vía aérea y células hepáticas también se indican. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: sugerido disposición de las placas de 24 pocillos para realizar un ensayo de CYP. (A) La disposición recomendada para los CYP expresadas constitutivamente incluye una serie de agujeros para el medio en blanco, La sonda metabólico, y el metabólica inhibidor sonda plus. Este diseño se puede multiplicar por el número de puntos de tiempo que se están probando. (B) La disposición de ejemplo para los CYP inducibles incluye una serie de bien para un espacio en blanco medio, una sonda metabólico único control, las células inducidas (por ejemplo, con TCDD) se incubaron con las sondas y se incubaron con las sondas y un inhibidor. Tabla 2: Dilución de Normas sintéticos utilizados para las curvas de calibración y LODs respectivos y LOQ. El intervalo de dilución de utilizar puede variar en función de la plataforma de espectrometría de masas y la sensibilidad. Aquí, se utilizó un espectrómetro de triple cuadrupolo híbrido / lineal de masas de trampa de iones vinculado a un UPLC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de estafigura. Tabla 3: luminógeno Probe, inductor y el inhibidor de CYP1A1 / 1B1 Ensayo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

Ejemplos de actividad metabólica medidos para dos pares de CYP (CYP1A1 / 1B1 y CYP2A6 / 2A13) en los cultivos de células de las vías respiratorias de tres donantes diferentes (las vías respiratorias M360, M370, M417) y la línea celular hepática (línea Hep) se muestran en la Figura 6 20. Actividad CYP medida por luminometría La Figura 6A muestra la luminiscencia relativa producida por la actividad de CYP1A1 / 1B1 O-desalquilación de Luc-CEE (luciferina 6'-cloroetil éter) en las células de las vías respiratorias (3 donantes) y las células hepáticas con y sin inducción de TCDD. CYP1A1 / 1B1 son enzimas altamente inducible y normalmente no se expresa a un nivel constitutiva en la mayoría de tejidos. Como puede verse en la Figura 6A, no se detecta señal luminógeno cuando no se inducen las células. Cuando ambos tipos de células se pre-incubaron con TCDD, un fuerte CYP1A1 / 1B1 inductor, una marcase detecta la señal ed luminógeno comparación con el control (Figura 6A). Esto indica que la sonda Luc-CEE ha sido metabolizado conduce a la liberación de la fracción de la luciferina que se cuantifica posteriormente. En general, la actividad de la línea celular hepática TCDD tratada es inferior a la de las células de las vías respiratorias, incluso después de la normalización de proteína total. Esto no es inusual puesto que las líneas de células tienden a ser menos activa metabólicamente que las células primarias. La adición de α-naftoflavona tiene un claro efecto inhibidor sobre la actividad de CYP1A1 / 1B1 en todos los tipos celulares que confirma aún más la CYP-dependencia del metabolismo Luc-CEE. La cuantificación de los metabolitos del CYP450 usando UPLC-MS La Figura 6B ilustra la cuantificación de CYP2A6 actividad / 2A13 en las células de las vías respiratorias a partir de 3 donantes (Airway M343, M345, M347) y las células hepáticas (línea Hep) después de la incubación con cumarina en presencia y ausencia del INHIbitor 8-metoxipsoraleno. Los datos se normalizaron para la proteína total. En el control de cumarina de incubación 0 min, no 7-hidroxicumarina se detecta (Figura 6B). CYP2A6 / 2A13 se expresan constitutivamente en ciertos tejidos y, por tanto, después de 16 h de incubación con la formación de cumarina de 7-hidroxicumarina se detecta en los diferentes tipos de células ensayadas, incluso sin inducción. Cuando 8-metoxipsoraleno, se añade un inhibidor CYP2A (Figura 6B), la formación de 7-hidroxicumarina se reduce considerablemente. Cabe señalar que, en presencia del inhibidor de CYP, es normal que todavía detectar alguna actividad residual como la inhibición rara vez es completa y ya que otros APP también puede ser capaz de reconocer el sustrato pero procesarlo mucho menos eficiente. También se puede observar que la actividad metabólica grabado puede ser diferente entre los donantes utilizando las células primarias, ya que es visible para el CYP2A6 en células de las vías respiratorias(Figura 6B). Se espera que la actividad del CYP es susceptible de genotipo y polimorfismos de cada donante. Figura 6: Ensayo de actividad de Resultado para CYP1A1 / 1B1 Actividad (A) y CYP2A6 / 2A13 actividad (B) en la línea celular hepática y en tres Airway Cell donantes (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE actividad desalquilación se muestra con y sin inducción de CYP1A1 / 1B1 por TCDD. α-naftoflavona fue utilizado como inhibidor de CYP1A1 / 1B1. La actividad se expresa como unidades relativas de luminiscencia (RLU) normalizados por el tiempo de incubación en minutos (min) y proteína total (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 no requieren inducción, ya que se expresan de forma constitutiva. La cumarina actividad 7-hidroxilación en las proteínas pmol / min / mg se muestra en diferentes puntos de tiempo con y sin el inhibidor de 8-methoxypsoralen. Todos los resultados se presentan como un valor medio de tres mediciones independientes con desviaciones estándar de la media. Esta cifra se modificó a partir Baxter 20. Suplementario Tabla 1: UPLC y ajustes del espectrómetro de masas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Actualmente, muchos sistemas de prueba toxicológicos normalizados utilizan bacterias modificadas, líneas celulares, o células embrionarias que no son representativos del metabolismo humano normal ^1. Esto puede conducir a predicciones inexactas de la potencial actividad tóxica de un producto químico o la medicina. Innovative en modelos in vitro, tales como cultivos de células en 3D y de órganos en un chip, están siendo desarrollados en un intento de replicar mejor la morfología normal y la actividad metabólica de los tejidos humanos ^{^21,} ^{^22,} ^23. competencia metabólica es un criterio que se puede utilizar para descifrar qué modelos son los más adecuados para los estudios de evaluación y de biotransformación de fármacos toxicológicos.

El protocolo que hemos descrito en este documento está diseñado para medir la actividad de las enzimas CYP utilizando células vivas. Es flexible y se puede utilizar para diferentes sistemas de células en 2D o 3D culturES y ofrece la opción de utilizar un probe- luminogénico o un enfoque basado en la espectrometría de masas. Ambos métodos son lo suficientemente sensibles para detectar cantidades de nanogramos de materiales y sólo requiere un pequeño número de células cultivadas en un formato de múltiples pocillos. También se pueden aplicar a esferoide o células cultivadas en matrices complejas. La selección del sustrato sonda es, obviamente, un elemento crítico del protocolo. La especificidad del ensayo se basa en la sonda de ser selectivos de la enzima CYP y otra capa de aseguramiento puede ser obtenido por el uso de un inhibidor CYP selectiva. Los sustratos e inhibidores mencionados en este documento son sólo algunos ejemplos, pero otros se pueden encontrar en la literatura.

Es importante tener en cuenta varios tiempos de incubación cuando se trabaja con un nuevo tipo de célula como resultado actividad de CYP negativo podría ser debido a la enzima que se expresa en un nivel bajo. La adición de un tipo de célula que se puede utilizar como un control positivo es aconsejable para garantizar que unaresultado negativo no está vinculado a un problema técnico y para ayudar con cualquier solución de problemas. células hepáticas primarias son metabólicamente competente y se pueden usar como control, para los hepatocitos primarios ejemplo en suspensión son muy fáciles de usar, pero su viabilidad es limitada en el tiempo. Líneas de células hepáticas son posibles alternativas que son relativamente fáciles de usar como se describe en este protocolo, pero algunos son mejores que otros en términos de actividad metabólica ^{^6,} ^21.

Dado que el ensayo es no destructivo, a menos que la proteína total se cuantifica, es posible seguir la actividad de CYP en el tiempo en los estudios longitudinales ^20. Este es un punto importante porque algunas células tendrán una actividad CYP variable en el tiempo en cultivo. Un resultado negativo podría estar asociado con la falta de confluencia, el progreso con la diferenciación o desdiferenciación in vitro. En ese caso, el enfoque es semi-quantitative ya que los datos no se normaliza por la cantidad total de proteína en cada cultivo celular. No siempre es posible o recomendado para reutilizar el tejido después de la medición de la actividad de CYP como la exposición a sondas, inhibidores o inductores puede tener un efecto tóxico en el tejido como es el caso para la TCDD.

fracciones de células tales como microsomas también podrían usarse para caracterizar la actividad de CYP de un tipo celular dado. De microsomas preparados, sin embargo, requieren una gran cantidad de material celular, la adición de cofactores adecuados y tampón para asegurar que las enzimas se mantienen activas. El uso de células vivas elimina la etapa de preparación de microsomas complicado y la elaboración de los cuales tampones y cofactores que mejor funcionan.

Como recomendación general, es una buena práctica para caracterizar mejor el perfil de expresión de APP en cultivos de células para verificar que coincida con la actividad enzimática. Este nivel adicional de verificación se recomienda dado que las sondas metabólicas no se entidependen específicos de un solo CYP y le da una mayor confianza de que la actividad metabólica medida se corresponde con la expresión de la enzima correspondiente. Desde APP son proteínas de membrana que son relativamente difíciles de preparar para transferencias de Western, por lo tanto, RT-PCR cuantitativa ha sido el enfoque preferido para perfilar estas enzimas ^20.

Es importante señalar que este protocolo describe un método para la actividad enzimática CYP ensayo que sólo representa una familia de enzimas metabólicas, aunque importante. La flexibilidad de un enfoque de espectrometría de masas permite el desarrollo de métodos de adquisición de otras transformaciones metabólicas de los sustratos de investigación. Sin embargo, aquellos que se han desarrollado uno a la vez y actualmente hay un menor número de sondas específicas conocidas e inhibidores selectivos para otras familias de enzimas metabólicas. Esta brecha debe ser dirigida a permitir una evaluación completa de la capacidad metabólica de las células in vitro en systeSra.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.

Materials

Reagent & Cells
2 μm syringe filter	Whatman	UN203NPEORG
24 well plate	Corning	3524
4-methylumbelliferone	Sigma Aldrich	M1381
5-phenyl pentyne	Sigma Aldrich	CD5001437
6-hydroxybupropion	Sigma Aldrich	H3167
6-hydroxychlorzoxazone	Sigma Aldrich	UC148
7-ethoxycoumarin	Sigma Aldrich	195642
7-hydroxycoumarin	Sigma Aldrich	H24003
8-methoxypsoralen	Sigma Aldrich	M3501
acetic acid	Sigma Aldrich	695092
acetonitrile	Fisher	A/0626/17
α-naphthoflavone	Sigma Aldrich	N5757
BCA kit	Thermo Scientific	23227
b-glucuronidase/arylsulfatase	Sigma Aldrich	G0876
Bupropion	Sigma Aldrich	B102
Carbamazepine	Sigma Aldrich	C4024
chlorzoxasone	Sigma Aldrich	C4397
collagen	Cell Systems	5005-B
coumarin	Sigma Aldrich	C4261
disulfiram	Sigma Aldrich	86720
fluvoxamine	Sigma Aldrich	F2802
Glutamax (Glutamine supplement)	Fisher	35050061
HepaRG metabolism supplement	Merck	MMAD621
HepaRG thaw media supplement	Merck	MMADD671
HepaRG	Merck	MMHPR116
Luciferin-CEE	Promega	V8751
methanol	Fisher	M/4056/17
MucilAir airway cells	Epithelix	EP01
MucilAir airway cells maintenance media	Epithelix	EP04MM
Phenomenex Kinetex 2.6μm, PFP 100A	Phenomenex	00B-4477-AN
TCDD	Sigma Aldrich	48599
thioTEPA	Sigma Aldrich	T6069
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8µm 2.1 x 50mm	Waters	86003538
Williams’ E media	Fisher	17704-024
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
UPLC	Waters	Acquity
QTRAP MS	Sciex	ABI Sciex 4000
QTRAP MS software	Sciex	Analyst 1.4.2
luminometer	Molecular Devices	SpectraMax M3
spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax M3
cell counter	Beckman Coulter	Vi-Cell XR
rotary evaporator	Eppendorf	Eppendorf-5301

Referenzen

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Baxter, A., Minet, E. Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures. J. Vis. Exp. (121), e55502, doi:10.3791/55502 (2017).