Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of <em>In Vitro</em> Cell Cultures

Andrew Baxter; Emmanuel Minet

doi:10.3791/55502

JoVE Journal > Biochemistry

Biochemie

Espectrometria de Massa e abordagens baseadas no Luminogenic Caracterizar Fase I Metabolic Competência de<em> In Vitro</em> culturas de células

Published: March 28, 2017

doi:

10.3791/55502

Andrew Baxter¹, Emmanuel Minet¹

¹Research and Development,British American Tobacco

Summary

Competência metabólica de sistemas in vitro é um requisito chave para a biotransformação e disposição de drogas e substâncias tóxicas. Neste protocolo, descrevemos a aplicação de sondas metabólicas referência para avaliar metabolismo de fase I em culturas de células.

Abstract

enzimas que metabolizam xenobióticos desempenham uma função chave na biotransformação de medicamentos e substâncias tóxicas através da adição de grupos funcionais que aumentam a solubilidade e facilitar a excreção. Em algumas ocasiões, essas modificações estruturais levar à formação de novos produtos tóxicos. A fim de reduzir os ensaios com animais, risco química pode ser avaliada utilizando as células metabolicamente competentes. A expressão das enzimas metabólicas, no entanto, não é estável ao longo do tempo, em muitos sistemas de cultura primária in vitro e é muitas vezes parcial ou ausente em linhas de células. Por conseguinte, o estudo de medicamentos, aditivos, e metabolismo poluentes do ambiente in vitro devem, idealmente, ser conduzida em sistemas celulares em que a actividade metabólica tenha sido caracterizados. Nós explicar aqui uma abordagem para medir a actividade de uma classe de enzimas metabólicas (Fase Humano I) em linhas celulares de culturas 2D e 3D primárias utilizando sondas químicas e os seus produtos metabólicos quantificáveis por espectrometria de massa e UPLCluminometria. O método pode ser implementado para testar a actividade metabólica em linhas celulares e células primárias derivadas de uma variedade de tecidos.

Introduction

O metabolismo é o processo através do qual os produtos químicos estranhos ao corpo são modificados pela adição de grupos hidrofílicos e conjugados para facilitar a sua excreção ^1. Tipicamente, o metabolismo de xenobiicos é um processo de dois passos com a Fase I que consiste principalmente de uma oxidação com a adição de um ou vários grupos ^hidroxilo, ¹ ^2. Na Fase II, os grupos hidroxilo são utilizados como aceitantes para um conjugado hidrofílico tal como glucuronida ou um radical sulfato de ^{^1,} ^2. Se um grupo aceitador já está presente nas moléculas, o passo de conjugação pode acontecer independentemente de Fase I metabolismo. Cada reacção é realizada por um grupo específico de enzimas, por exemplo, os CYP (citocromo P450), que catalisam a hidroxilação (Figura 1) e desalquilação de substratos químicos ^3. Conjugation é catalisada por sulfotransferases, UDP-glucuronosiltransferases (Figura 1), glutationa-S-transferases e N-acetiltransferases ^4. Cada tecido e órgão terá um perfil específico da expressão da enzima metabólica, com o fígado que expressam mais dessas proteínas.

Figura 1: Exemplo de Fase I e Fase II Metabolismo de cumarina. CYP2A6 / CYP2A13 catalisar a 7-hidroxilação da cumarina. 7-hidroxicumarina é conjugado com uma porção glucuronido por enzimas de fase II UGTs, com UGT1A6 e UGT1A9 mostrando a actividade mais elevada.

Compreendendo o metabolismo de xenobiicos é crítica na avaliação da segurança da droga e para a avaliação dos riscos químicos, por duas razões: a cinética da reacção irá determinar quanto tempo uma droga ou substância química permanecerá no corpo numa forma activa ou inactiva bntes de excreção; e o composto parental pode ser modificada para uma espécie mais reactiva, instável e tóxico por enzimas metabólicas. Tais reacções também conhecidos como "bio-activação" são principalmente conduzidos por enzimas CYP fase I mas também em raras ocasiões, de fase II conjugação ^5.

Com base nisso, a capacidade de um modelo in vitro para prever com precisão o risco associado com um fármaco ou um produto químico é altamente dependente da competência metabólica do sistema celular. As linhas celulares derivadas a partir de tecidos doentes ou de transformação de células normais, muitas vezes perdem parte se não todo o perfil representativo enzima metabólica do seu tecido de origem ^6. A manutenção do perfil de enzima metabólica normal, parece ser melhor em culturas de células primárias (pelo menos em culturas de curto prazo) e é ainda melhorado se o tecido é cultivadas numa matriz que lhe permita reter a sua estrutura 3D ^1. Portanto, o caracterecarac- da competência metabólica de um sistema de células in vitro é um passo preliminar importante na orientação a decisão sobre qual modelo de celular é apropriado para conduzir avaliações de segurança química.

Neste trabalho foi realizado um protocolo ao perfil da actividade e expressão de enzimas de fase I de CYP in vitro com exemplos da sua aplicação com uma linha celular hepática ⁷ e 3D culturas de células de pulmão primário ^8. CYP substratos específicos, os seus produtos metabólicos e inibidor controlos são descritos, juntamente com spectrometry- massa e métodos de quantificação baseado no luminogenic. Uma vez que alguns CYP são induzida e outros são constitutivas, também será dado exemplos para os dois cenários.

Protocol

NOTA: O fluxo geral para o ensaio de actividade metabólica está delineado na Figura 2. Cada passo desse fluxo de trabalho é posteriormente detalhada nos próximos parágrafos. Tabelas detalhadas de reagentes e equipamentos são dadas na Tabela de Materiais. Figura 2: fluxo de trabalho para a metabólica Probe Assay. As células são semeadas e crescidas até uma densidade adequada. Um passo de indução de CYP pode ser necessária, dependendo da actividade da enzima ensaiada. O substrato e inibidor sonda é adicionada à cultura de células. Após um período de incubação, o meio é recolhido para análise e as células são lisadas para a quantificação de proteína. O meio é processado para análise do produto metabólico do substrato de sonda por espectrometria de massa ou luminometria.ad / 55502 / 55502fig2large.jpg" target = '_ blank'> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Cultura 1. celular Figura 3: Transmissão de luz Micrography de uma célula hepática Cultura Line. A linha de células descrito neste protocolo 5 tipicamente diferenciar com uma divisão de 50% entre cholangiocytes e hepatócitos em cultura (100x). Barra de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Cultura linha celular hepática NOTA: A linha de células hepáticas disponível comercialmente foi usado como um exemplo de células metabolicamente competentes. A linha celular foi derivada de um carcinoma hepatocelular causada por infecção viral 7. Na confluência, esta linha de células se diferenciam em células de hepatócitos cholangiocyte- e semelhantes (Figura 3) e mais pormenores podem ser encontrados em Guillouzo 7. A inclusão de DMSO a 2% para o meio de cultura apoia a diferenciação de esta linha de células e expressão de uma variedade de CYP. Retirar os frascos criogénicos com células a partir do azoto líquido e colocar em gelo seco durante o transporte. Transferir o criotubo para um banho de água pré-aquecido a 37 ° C durante 1-2 minutos, e esterilizar o exterior de um frasco com etanol a 70% antes de colocar em uma câmara de fluxo laminar. Apesar de trabalhar sob condições estéreis, abriu-se cuidadosamente o frasco criogénico para libertar o excesso de pressão e pipetar o conteúdo do criotubo para um tubo de 10 ml, cheio com 9 mL de meio E de Williams pré-aquecido a 37 ° C. Centrifugar a solução durante 10 min a 400 xg à temperatura ambiente, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL demeio de degelo proprietária pré-aquecido a 37 ° C, suplementada com glutamina ou um suplemento de glutamina (concentração final 2 mM) (Williams suplemento E + glutamina + suplementos descongelação). Contagem de células viáveis utilizando uma alíquota de 500 uL com um contador de células ou qualquer outra técnica de contagem de células adequada. Semear as células em uma placa revestida com colagio de 24 pos a uma densidade de 0,6 x 10 6 culas vieis / poço num volume final de 0,5 mL de meio de degelo. Colocar a placa (s) em uma incubadora a 37 ° C com um 5% / 95% de CO2 / ar e 100% de humidade relativa. 24 h ap a sementeira das células, substituir o meio com 0,5 ml de meio de trabalho pré-aquecido manutenção / metabolismo (Williams suplemento E + glutamina + suplemento metabolismo (este meio já contém DMSO)). Alterar o meio a cada dois dias. Após alguns dias em cultura as células formam uma estrutura trabecular sub-confluentes (Figura 3). O metabólica idealactividade é tipicamente observada entre o dia 7 e 10 e é mais baixo no dia 4. Figura 4: Corte Transversal de células das vias respiratórias Alcian Blue manchados crescidas na interface ar-líquido 8. Ciliado, produtoras de muco e de células basais são claramente visíveis. Barra de escala = 250 pm. Culturas das vias aéreas epiteliais diferenciadas NOTA: O protocolo é mostrado com um epitélio das vias respiratórias primário totalmente diferenciada disponível comercialmente cultivadas na interface ar-líquido sobre uma inserção 8 (Figura 4). A cultura do tecido mantém um fenótipo mucociliar e da polaridade celular 8. As células podem ser de origem nasal ou brônquica. Aqui, usar células nasais humanas. As células são entregues a um formato de placa de cultura com 24insere na interface ar-líquido. Para facilitar o transporte e evitar o derramamento forma as inserções são enviados com a secção base incorporado em uma matriz de agarose misturado com meio de cultura. Após a entrega das células, esterilizar as placas contendo as inserções 24 com uma solução de etanol a 70% antes de colocar em uma câmara de fluxo laminar limpo. Prepara-se uma placa de 24 poços estéril por adição de pré-aquecido a 700 pL de meio de cultura proprietária. Usando pinças estéreis transferir as inserções de células para a nova placa pré-carregado com meio de desalojar suavemente a inserção a partir da matriz de agarose. Colocar a placa (s) em uma incubadora a 37 ° C com um 5% / 95% de CO2 / ar e 100% de humidade relativa. A cada 2 dias transferir as inserções para uma nova estéril placa de 24 poços pré-carregado com 700 uL de meio de cultura de células das vias respiratórias proprietária quente. Avaliar a integridade do tecido das vias aéreas utilizando modos, tais como a resistência trans-epitelial (TEER), oucílios bater frequência (CBF), utilizando um microscópio equipado com um sistema de imagem de vídeo ao vivo 9. A medição de TEER e CBF é descrito em Kuehn 10. 2. CYP Atividade Quantificação em culturas de células NOTA: Como uma regra geral, os solventes, tais como DMSO e metanol pode ser usado para preparar soluções de reserva para as diferentes sondas metabólicas e inibidores apresentados neste documento. No entanto, recomenda-se manter a concentração final de DMSO no meio de cultura a um mínimo (1% ou inferior) uma vez que elevadas concentrações pode inibir enzimas metabólicas. Quando possível, é também recomendado para uso sem vermelho de fenol e meio isento de soro durante a incubação com sondas metabólicas desde vermelho de fenol pode interferir com a actividade da enzima CYP e Fase II e componente do soro tal como a albumina pode diminuir a disponibilidade da sonda. Nem sempre é possível respeitar estritamente estes diretrizes. Por exemplo, meio de cultura de células das vias respiratórias é proprietária e contém fenol vermelho. A linha de células hepáticas Proprietary meio metabolismo 7 já contém DMSO acima de 1%, uma vez que é necessário para que as células se adoptar o fenótipo de hepatócitos semelhante. NOTA: Finalmente, aqui, o termo específico sonda / inibidor é usado, mas esta terminologia tem de ser considerado com cautela. De facto, é muito raro que uma sonda metabólico ser um substrato exclusiva enzima. As sondas descritas aqui, no entanto, têm uma afinidade elevada para o seu alvo de enzima e, portanto, são considerados como marcadores de confiança de actividade. Metabólicas sondas, indutores e inibidores As sondas que utilizam os métodos baseados Espectrometria de Massa NOTA: As sondas e inibidores descritos nesta secção são adequadas para testar a actividade de CYP2As 11, CYP1A2 12,Ref "> 13, CYP2B6 7, 14, CYP2F1 15, 16, e CYP2E1 17 por espectrometria de UPLC-massa. As sondas, inibidores e CYP correspondente são descritas no Quadro 1, com números de referência correspondentes. Tabela 1 também lista o produto metabólico do CYP actividade que é quantificada por espectrometria de massa. todo o trabalho envolvendo cultura de tecidos e soluções para utilização em cultura de tecidos deve ser realizada num capuz de cultura de tecido estéril. uma solução de reserva pode ser preparado em DMSO para todos os substratos de sonda. Antes do experimento preparar duas séries de inserções celulares ou poços, usar uma série para a experiência de inibição, o outro para a sonda metabólica única. Prepara-se uma terceira série de células como um controlo em branco forma. Eles podem ser separados em placas ou nas mesmas placas com um mínimo de três réplicas. Um exemplo de placa de estabelecerpara fora é apresentada na Figura 5. No dia da expericia, substitui o meio de cultura de células com 450 uL de meio fresco. Prepara-se por uma capa estéril numa concentração das seguintes soluções utilizando o meio de cultura de células de 10x. Misture sonda 10x CYP, inibidor de CYP 10x, 10x e inibidor de CYP mais 10x sonda. NOTA: As soluções de estoque principal de inibidor e a sonda podem ser preparados em DMSO 100% (por exemplo, 1000X stocks) e ainda mais diluído em meio para se obter uma solução 10x, a fim de evitar uma concentração de DMSO final em excesso de 1%, com a cultura de células . As concentrações finais de 1x que estão destinadas para a incubação com as células estão apresentados na Tabela 1. Filtra-se a solução diferente 10x sonda com um filtro de seringa de 0,2. Adicionar 50 uL de meio contendo o inibidor de CYP 10x para a série de células preparadas para o ensaio de inibição e a pré-incubar durante 30 min. REColoque a forma de células na série de inibição com 450? L de meio fresco e adicionar 50? L de meio contendo tanto 10x inibidor de CYP e o substrato 10x sonda. Adicionar a outras células 50 uL do meio com o substrato sonda 10x e adicionar uma quantidade equivalente de veículo diluído em meio (por exemplo, DMSO) para os controlos de células em branco, como mostrado na Figura 5. Incubar as células durante 0-5 minutos (tempo 0, controlo do fundo) e 16 h na incubadora celular. NOTA: O tempo de incubação foi utilizado com sucesso com as células das vias respiratórias e linha celular hepática; no entanto frescos hepatócitos primários têm uma alta competência metabólica, enquanto se aguarda a qualidade da preparação de células e a composição genética do doador, por conseguinte, tempos mais curtos (por exemplo, 2-4 h) pode ser adequado. É sempre recomendável para executar um experimento de curso de tempo ao testar diferentes linhas celulares ou tipos de células. No final do período de incubação, collect o meio em tubos etiquetados separados para a quantificação do produto metabólico das sondas. Congelar o meio para processamento futuro. Lisar as células para a quantificação de proteína. NOTA: Qualquer kit de quantificação de proteína padrão e o protocolo é adequado para este passo. BCA é uma opção adequada. Este passo é opcional, se as células têm de ser utilizado em outro ensaio. tratamento médio NOTA: O meio recolhido a partir da fase de incubação contém o produto químico sonda pai, bem como dos seus produtos metabólicos. Para medir a actividade de CYP específico apenas o produto da reacção catalisada pela CYP de interesse deve ser quantificada. Fase I produtos do metabolismo são muitas vezes processados em conjunto com o metabolismo de fase II (conjugação) e, portanto, não pode ser detectado como tal. Assim, a fim de obter a quantificação mais precisa de uma actividade de CYP, um passo desconjugação é necessário para remover quaisquerFase II modificação metabolismo. Uma vez que a conjugação de Fase I metabolitos muitas vezes envolve a glucuronidação ou sulfatação, desconjugação é alcançado por tratamento das amostras por glucuronidases e sulfatases 18. Glucuronidase e atividade de sulfatase é dependente com maior actividade glucuronidase pH ser conseguida a pH 4,5-5,0 e sulfatase actividade sendo mais elevada a um pH de 6,0-6,5. Portanto, este passo requer o ajustamento do pH. No método aqui descrito, medimos o pH utilizando tiras de pH, por razões práticas uma vez que as sondas mais medidores de pH não se encaixam em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. tiras de pH comercialmente disponíveis podem ser encontradas com uma resolução tão baixo como 0,3 a 0,2 unidades de pH. Transferir 250 uL de meio de incubação para um microtubo de 1.5 ml e adicionar solução estoque padrão interno de 4-metilumbeliferona para atingir uma concentração final de 100 nM. Ajustar o pH do meio para 4,5-5,0 por adição de HCl 1M. Adicionar 1 mL de HCl a uma vez e verificar pHpipetando 2 uL de meio sobre uma tira de pH. Atingir um pH de 5,0 seria normalmente não requerem mais de 5-10 mL de HCl 1M. Adicionar 150 unidades (1,8 ul de um estoque de 85.000 unidades / ml) de β-glucuronidase / arilsulfatase de Helix pomatia e incubar durante 1 h a 37 ° C. Parar a reacção por adição de 250 mL de metanol frio (-20 ° C). Armazenar as amostras a -20 ° C ou ainda processo. Evapora-se o solvente, utilizando uma centrifugadora de vácuo a 45 ° C. Reconstituir as amostras com 500 uL de acetonitrilo a 30%: Solução de água. As amostras estão prontas para análise por espectrometria de massa e pode ser armazenado a -20 ° C em frascos amber glass. Espectrometria de Massa quantificação com base Nota: Todas as UPLC e espectrômetro de massa configurações estão detalhadas no dedicado Tabela Suplementar 1. Para uma análise quantitativa, estabelecendo uma curva de calibração é necessária. o calibration curva é obtida através da execução de uma série de diluições do composto conhecido para ser quantificado. Neste caso, as curvas de calibração foram gerados ao longo de 10 concentrações diferentes (Tabela 2), pelo menos seis dos quais deve estar dentro de 20% do intervalo linear 19. O mais baixo nível de detecção é determinada como a concentração mais baixa que dá um sinal maior do que, ou igual a 3 x a média do sinal de fundo. O nível mais baixo de quantificação é determinado como a menor concentração de amostra que dá um sinal de uma maior ou igual a 10 vezes o sinal de fundo média ambos os quais são determinados ao longo de pelo menos 3 ensaios independentes, com amostras em triplicado. Prepara-se uma diluição em série de um metabolito sintético no meio de cultura de tecidos de acordo com a Tabela 2, incluindo o padrão interno. Um volume final de 250 mL por diluição padrão é adequada. Evapora-se as diluições em série de padrão, tal como descrito em rEP 2.1.2.4 e ressuspender em um volume de 30% de acetonitrilo: água equivalente ao volume do meio de evaporação antes (por exemplo, 250 pL de 30% de acetonitrilo: água se a solução padrão de partida foi de 250? L de meio). Adicionar 250 ul de cada padrão de diluição em série para um frasco de vidro âmbar UPLC para injecção no amostrador automático UPLC-MS. Adicionar as amostras de teste (250 uL) para frascos âmbar UPLC e colocá-los no amostrador automático UPLC. Randomize todos os frascos. NOTA: A configuração espectrómetro de massa foi utilizado um espectretro de massa triplo quadrupolo ion trap / linear híbrido acoplado a uma UPLC detalhado na Tabela Suplementar 1. Outras plataformas teria software e configuração diferente, mas que siga os passos semelhantes para realizar a quantificação. Executar o UPLC-MS utilizando as definições detalhadas na Tabela Suplementar 1, dependendo da sonda específica para quantificar. Usaro "Quantificar – Construir Modo de quantificao" ferramenta em ferramentas de quantificação espectrómetro de massa (Tabela de Materiais) para gerar a curva de calibração a partir do padrão sintético adquirido e do padrão interno. Use "Assistente Quantificação" para seleccionar o lote de amostra e as amostras para quantificar e executar o "Método de Quantificação". O software espectrómetro de massa quantificação exibe uma folha de cálculo com os valores de quantificação do composto alvo em cada amostra de teste. As sondas que utilizam métodos de luminescência baseado NOTA: sondas Luminogenic para medir uma variedade de actividades CYP estão comercialmente disponíveis; no entanto, nem todos são adequados para ensaios baseados em células. Aqui, um protocolo é apresentada para medir a atividade do CYP1A1 / CYP1B1. CYP1A1 / 1B1 foi escolhido para ilustrar a forma de ensaiar a actividade de CYP indutíveis e para dar um exemplo de como sondas luminogenic pode ser usado como um alternativo para métodos baseados em espectrometria de massa. A Tabela 3 resume as concentrações e tempo de incubação foi utilizado para as células das vias respiratórias e a linha de células hepáticas; no entanto, aqueles que podem ter de ser adaptados para outros tipos de células. Outras sondas luminogenic estão comercialmente disponíveis e podem ser utilizados como substratos para uma variedade de CYP. Preparar células suficientes para incluir um controlo não induzido, um teste induzida, e um teste + induzida inibidor. Um exemplo de uma disposição da placa está mostrado na Figura 5B. Para induzir a CYP1A1 / 1B1, incubar as células com uma concentração final de 10 nM a TCDD em meio durante um período de 72 h (períodos mais curtos de 24 a 48 h, pode também ser adequados). CUIDADO: TCDD é um agente cancerígeno e teratogênico. Usar equipamento de protecção adequado, rever o fornecedor MSDS e realizar uma avaliação de risco antes de usar. Após este período, remover o meio, lavar os poços com PBS 3 vezes, e adicionar um pouco de meio fresco. Prior a incubação das células com a sonda repórter luminogenic, pré-incubar o subconjunto designado de células induzidas durante 30 minutos com uma concentração final de 10 uM CYP1A1 / 1B1 inibidor, α-naftoflavona, em meio. Adicionar a sonda luminogenic LUC-CEE (luciferina 6'-cloro-etil éter) a uma concentração final de 50 uM para as células não-induzidas, induzidas e induzidas + inibidor. Incuba-se durante 4 h numa incubadora de cultura de células. No final do tempo de incubação de recolher o meio, para a quantificação da sonda luminogenic. Transferir 25 uL de meio de cultura para uma placa de 96 cavidades opaca branca e adicionar 25 uL de reagente de detecção luciferina fornecidas pelo fabricante. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Leia a placa imediatamente, usando um luminómetro. Lavam-se as células com PBS e lise para a quantificação de proteína total. NOTA: Este passo é opcional, se as células vivas são retidos para experiências futuras. Eut é importante notar, contudo, que os indutores, tais como TCDD são tóxicos e pode danificar as células. Tabela 1: Lista de metabólicas sondas, os produtos e os inibidores com a sua enzima correspondente. peso molecular e as concentrações recomendadas usadas com as vias respiratórias e células hepáticas são também indicados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: sugerida de 24 poços disposição da placa para efectuar um ensaio de CYP. (A) O esquema recomendado para CYP constitutivamente expressos inclui uma série de cavidades para a forma em branco, A sonda metabólica, e o inibidor metabólico sonda plus. Este layout pode ser multiplicado pelo número de pontos no tempo que estão sendo testados. (B) O esquema exemplo para os CYP indutíveis inclui uma série de bem para um meio em branco, uma sonda metabólica apenas um controlo, as células induzidas (por exemplo, com TCDD) incubadas com as sondas e incubadas com as sondas e um inibidor. Tabela 2: Diluição de padrões sintéticos utilizados para as curvas de calibração e LODs respectiva e limites de quantificação. A gama de diluição para utilizar podem variar de acordo com a plataforma de espectrometria de massa e sensibilidade. Aqui, usamos um triplo espectrômetro de massa ion trap quadrupolo / linear híbrida ligada a uma UPLC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura. Tabela 3: Luminogenic sonda, indutor e como inibidor de CYP1A1 / 1B1 Ensaio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Representative Results

Exemplos de actividade metabólica medidos para dois pares de CYP (CYP1A1 / 1B1 e CYP2A6 / 2A13) nas culturas de células das vias respiratórias a partir de três dadores diferentes (das vias aéreas M360, M370, M417) e a linha de células hepáticas (linha Hep) são mostrados na Figura 6 20. Actividade medida por luminometria CYP A Figura 6A mostra o luminescência relativa resultante da actividade de CYP1A1 / 1B1 O-desalquilação de Luc-CEE (luciferina éter 6'-cloroetil) em células das vias respiratórias (3 dadores) e células hepáticas com e sem indução TCDD. CYP1A1 / 1B1 são enzimas altamente induzíveis e, tipicamente, não são expressas a um nível constitutiva na maioria dos tecidos. Como pode ser observado na Figura 6A, nenhum sinal é detectado luminogenic quando as células não são induzidos. Quando ambos os tipos de células são pré-incubadas com a TCDD, uma forte CYP1A1 / indutor 1B1, uma marcasinal ed luminogenic é detectado em comparação com o controlo (Figura 6A). Isto indica que a sonda Luc-CEE foi metabolizado líder para a libertação da porção de luciferina que é quantificado posteriormente. Em geral, a actividade da linha celular hepática tratados TCDD é menor do que para as células das vias respiratórias, mesmo após normalização de proteína total. Este não é invulgar, uma vez linhas de células tendem a ser menos metabolicamente activa do que as células primárias. A adição de α-naftoflavona tem um efeito inibidor evidente sobre a actividade de CYP1A1 / 1B1 em todos os tipos de células que confirma ainda mais o CYP-dependência do metabolismo Luc-CEE. A quantificação dos metabolitos do CYP450 usando UPLC-MS A Figura 6B ilustra a quantificação da actividade de CYP2A6 / 2A13 em células das vias respiratórias a partir de 3 dadores (Airway M343, M345, M347) e células hepáticas (linha Hep) após incubação com cumarina na presença e na ausência do inhiBITOR 8-metoxipsoraleno. Os dados são normalizados para proteína total. No controlo cumarina incubação 0 min, nenhuma 7-hidroxicumarina é detectado (Figura 6B). CYP2A6 / 2A13 são expressos constitutivamente em determinados tecidos e, portanto, depois de 16 h de incubação, com formação de cumarina 7-hidroxicumarina é detectado nos diferentes tipos de células testadas, mesmo sem indução. Quando o 8-metoxipsoraleno, de um inibidor de CYP2A é adicionada (Figura 6B), a formação de 7-hidroxicumarina é consideravelmente reduzido. Deve notar-se que na presença do inibidor de CYP, é normal ainda detectar alguma actividade residual como inibição raramente é completa e uma vez que outros CYP pode também ser capaz de reconhecer o substrato mas processar-se muito menos eficientemente. Também pode ser observado que a actividade metabólica gravado pode ser diferente entre os doadores quando se utiliza células primárias, uma vez que é visível para CYP2A6 em células das vias respiratórias(Figura 6B). Isto é esperado como actividade CYP é susceptível de genótipo e de polimorfismos de cada doador. Figura 6: Ensaio de Actividade Resultado para CYP1A1 / 1B1 Actividade (A) e CYP2A6 2A13 actividade / (B) na linha de células hepáticas e em três das vias aéreas celular Doadores (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE actividade desalquilação é mostrado com e sem indução de CYP1A1 / 1B1 por TCDD. α-naftoflavona foi utilizado como inibidor de CYP1A1 / 1B1. A actividade é expressa como unidades relativas de luminesccia (RLU) normalizados por hora de incubação em minutos (min) e a proteína total (mg). (B) de CYP2A6 / 2A13 não requerem indução como eles são expressos constitutivamente. Cumarina actividade 7-hidroxilação em proteínas pmol / min / mg é mostrada em diferentes pontos de tempo, com e sem o inibidor de 8-methoxypsorAlen. Todos os resultados são apresentados como um valor médio de três medições independentes com desvios padrão da média. Esta figura foi modificado a partir de Baxter 20. Tabela Suplementar 1: UPLC e configurações espectrômetro de massa. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Discussion

Actualmente, muitos sistemas de testes toxicológicos padronizados utilizar bactérias Engineered, linhas celulares, ou células embrionárias, que não são representativos do metabolismo humano normal ^1. Isso pode levar a previsões imprecisas do potencial actividade tóxicos de uma substância química ou medicina. Inovador em modelos in vitro, como culturas de células de órgãos e 3D sobre um chip, estão a ser desenvolvidos na tentativa de melhor replicar a morfologia normal e a actividade metabólica dos tecidos humanos ^{^21,} ^{^22,} ^23. competência metabólica é um critério que pode ser usado para decifrar quais modelos são mais adequados para estudos de avaliação e de biotransformação de drogas toxicológicos.

O protocolo temos descrito neste documento destina-se a medir a actividade de enzimas CYP, utilizando células vivas. É flexível e pode ser usado para diferentes sistemas de células em 2D ou 3D cultures e oferece a opção de usar um probe- luminogenic ou uma abordagem baseada em espectrometria de massa. Ambos os métodos são suficientemente sensível para detectar quantidades de nanogramas de materiais e requerem apenas um pequeno número de células cultivadas em um formato com múltiplas cavidades. Eles também podem ser aplicados a esferóides ou células cultivadas em matrizes complexas. A selecção do substrato de sonda é, obviamente, um elemento crítico do protocolo. A especificidade do ensaio baseia-se na sonda a ser selectiva da enzima CYP e uma outra camada de garantia pode ser obtida pela utilização de um inibidor de CYP selectiva. Os substratos e inibidores enumerados no presente documento são apenas alguns exemplos, mas outros podem ser encontrados na literatura.

É importante considerar vários tempos de incubação quando se trabalha com um novo tipo de célula como um resultado negativo da actividade de CYP pode ser devido à enzima ser expressa num nível baixo. A adição de um tipo de célula que pode ser usada como um controlo positivo é aconselhável assegurar que umresultado negativo não está ligada a um problema técnico e para ajudar com qualquer solução de problemas. células hepáticas primárias são metabolicamente competente e pode ser usado como controle, para hepatócitos primários exemplo em suspensão são muito fáceis de usar, mas a sua viabilidade é limitada no tempo. Linhas de células hepáticas são possíveis alternativas, que são relativamente fáceis de utilizar, conforme descrito no presente protocolo, mas algumas são melhores do que outros em termos de actividade metabólica ^{^6,} ^21.

Uma vez que o ensaio não é destrutivo, a menos que a proteína total é quantificado, é possível seguir a actividade de CYP ao longo do tempo em estudos longitudinais ^20. Este é um ponto importante porque algumas células terão actividade CYP variável ao longo do tempo na cultura. Um resultado negativo pode ser associada com a falta de confluência, com o progresso ou a diferenciação in vitro de desdiferenciação. Nesse caso, a abordagem é semi-quantitative uma vez que os dados não é normalizada pela quantidade total de proteína em cada cultura de células. Não é sempre possível ou recomendado para reutilizar o tecido depois de medir a actividade de CYP como exposição a sondas, inibidores ou indutores pode ter um efeito tóxico sobre o tecido, como é o caso para TCDD.

fracções de células, tais como microssomas, também poderia ser usado para caracterizar a actividade de CYP de um determinado tipo de célula. Microssomas preparações, no entanto, requerem uma grande quantidade de material celular, a adição de co-factores adequados e tampão para assegurar que as enzimas permanecer activo. Usando células vivas elimina a etapa de preparação microsome complicado e trabalhar fora que buffers e cofatores funcionar melhor.

Como recomendação geral, é uma melhor prática para caracterizar ainda mais o perfil de CYP expressão em culturas de células para verificar se ele corresponde a actividade enzimática. Este nível adicional de verificação é recomendado, uma vez que as sondas metabólicas não são enticonfiar específico para um único CYP e proporciona maior confiança que a actividade metabólica medida é compensada pela expressão da enzima correspondente. Uma vez que os CYP são proteínas de membrana que são relativamente difíceis de preparar por western blots, portanto, RT-PCR quantitativo tem sido a abordagem preferida para estas enzimas perfil ^20.

É importante notar que este protocolo descreve um método para ensaio de actividade de enzima CYP que apenas representa uma família de enzimas metabólicas, embora importante. A flexibilidade de uma abordagem de espectrometria de massa permite que o desenvolvimento de métodos de aquisição para outras transformações metabólicas dos substratos de sonda. No entanto, aqueles têm de ser concebidos um de cada vez e não existem actualmente menos sondas específicas conhecidas e inibidores selectivos para outras famílias de enzimas metabólicas. Esta lacuna deve ser endereçada para permitir uma avaliação abrangente da competência metabólica em syste de células in vitroSenhora.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.

Materials

Reagent & Cells
2 μm syringe filter	Whatman	UN203NPEORG
24 well plate	Corning	3524
4-methylumbelliferone	Sigma Aldrich	M1381
5-phenyl pentyne	Sigma Aldrich	CD5001437
6-hydroxybupropion	Sigma Aldrich	H3167
6-hydroxychlorzoxazone	Sigma Aldrich	UC148
7-ethoxycoumarin	Sigma Aldrich	195642
7-hydroxycoumarin	Sigma Aldrich	H24003
8-methoxypsoralen	Sigma Aldrich	M3501
acetic acid	Sigma Aldrich	695092
acetonitrile	Fisher	A/0626/17
α-naphthoflavone	Sigma Aldrich	N5757
BCA kit	Thermo Scientific	23227
b-glucuronidase/arylsulfatase	Sigma Aldrich	G0876
Bupropion	Sigma Aldrich	B102
Carbamazepine	Sigma Aldrich	C4024
chlorzoxasone	Sigma Aldrich	C4397
collagen	Cell Systems	5005-B
coumarin	Sigma Aldrich	C4261
disulfiram	Sigma Aldrich	86720
fluvoxamine	Sigma Aldrich	F2802
Glutamax (Glutamine supplement)	Fisher	35050061
HepaRG metabolism supplement	Merck	MMAD621
HepaRG thaw media supplement	Merck	MMADD671
HepaRG	Merck	MMHPR116
Luciferin-CEE	Promega	V8751
methanol	Fisher	M/4056/17
MucilAir airway cells	Epithelix	EP01
MucilAir airway cells maintenance media	Epithelix	EP04MM
Phenomenex Kinetex 2.6μm, PFP 100A	Phenomenex	00B-4477-AN
TCDD	Sigma Aldrich	48599
thioTEPA	Sigma Aldrich	T6069
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8µm 2.1 x 50mm	Waters	86003538
Williams’ E media	Fisher	17704-024
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
UPLC	Waters	Acquity
QTRAP MS	Sciex	ABI Sciex 4000
QTRAP MS software	Sciex	Analyst 1.4.2
luminometer	Molecular Devices	SpectraMax M3
spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax M3
cell counter	Beckman Coulter	Vi-Cell XR
rotary evaporator	Eppendorf	Eppendorf-5301

Referenzen

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Baxter, A., Minet, E. Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures. J. Vis. Exp. (121), e55502, doi:10.3791/55502 (2017).