המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics
Summary
גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.
Abstract
מיסודם חלבונים מופרעים (עקור) כבר זמן רב אתגר לביולוגים מבניים עקב חוסר אלמנטי מבנה משני יציבה. מימן-דאוטריום Exchange (HDX) למדידה בסקאלות זמן מהירות מתאים באופן ייחודי כדי לזהות מבנים ורשתות מליטת המימן כי מאוכלסות בקצרה, המאפשר האפיון של conformers חולף בהרכבים מקומיים. עגינת HDX כדי ספקטרומטריית מסה מציעה יתרונות מרכזיים, כולל רגישות גבוהה, צריכת מדגם נמוכה ואין הגבלה על גודל חלבון. טכניקה זו התקדמה מאוד בעשורים האחרונים, כולל היכולת לפקח פעמים תיוג HDX על ציר הזמן אלפית השנייה. בנוסף, על ידי שילוב זרימת עבודת HDX גבי פלטפורמת microfluidic אירוח הפקת microreactor פרוטאז חומצי, אנחנו מסוגלים למקם תכונות דינמיות ברמת פפטיד. במחקר זה, זמן-נפתרה electrospray יינון ספקטרומטריית מסה (TRESI-MS) מצמידים HDX ווההים משמש כדי לספק תמונה מפורטת של מבנה שיורית חלבון טאו, כמו גם את משמרות קונפורמציה המושרות על hyperphosphorylation.
Introduction
במהלך העשורים האחרונים, התקדמות משמעותית נעשתה בפיתוח שיטות אנליטיות שנועדו למדוד את מבנה חלבון ואת דינמיקת 1, 2, 3, 4. בעוד קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן נותר כלי העיקרון לקביעת מבנה החלבון, ריכוז גבוה של חלבון נחוצים ואופטימיזציה נרחב נדרש לייצר גבישים באיכות עקיפה. חלבונים שקשה לגבש, כגון חלבונים בממברנה הקשורים בו אי סדר מיסודם נחקרו קלאסי ידי חילופי מימן-דאוטריום (HDX) התמ"ג 5. עם זאת, בעשורים האחרונים, צימוד של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון (ESI-MS) כדי HDX צבר במהירות פופולרית 6, 7.
ספקטרומטריית מסה מציעה פתרוןלרבים המגבלות שמציב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו- NMR. בפרט, MS הוא מאוד רגיש (ננומטר לריכוזים מיקרומטר חובה), ואין כמעט שום מגבלה על גודל החלבון. בנוסף, מחזור העבודה הגבוה של ניתוח MS מאפשר לאפשרות של לימוד חלבונים כפי שהם עוברים מחזור אנזימטי, misfolding, complexation ותהליכים ביולוגיים-רלוונטיים אחרים. תהליכים אלה מתרחשים לעתים קרובות על האלפית השני בקנה המידה שנייה זמן ודורשים ערבוב מהיר של ריאגנטים לפני הניתוח.
התפתחות electrospray יינון זמן לפתור (TRESI) על ידי וילסון Konermann ב 2003 תגובות מותרות להיות במעקב בזמן פסאודו-אמת על ידי ESI-MS. ההתקנה שלהם שולבה מיקסר נימים עם נפח תא תגובת מתכוונן ברציפות 8. המכשיר מורכב משתי נימים קונצנטריים, עם הנימים הפנימיות אטום חריץ וחותכי הצד שלה, כדי לאפשר ערבוב בתוך הבין-קַפִּילָאר הצרמרחב y מן החריץ עד הסוף של הנימים הפנימיות (בדרך כלל 2 מ"מ). כאשר חלים ניסויי HDX, הנימים הפנימיות נושאות את החלבון של עניין, הנימים החיצוניות נושאות את התיוג D 2 O פתרון, אשר ולאחר מכן עובר ערבוב עם החלבון לפני הכניסה לתא תגובת מתכוונן המאפשר תיוג HDX לפני העברה ישירה לתוך ESI מָקוֹר.
בקצרה, HDX מסתמך על מימנים אמידים עמוד שדרה עוברים חילופי עם אטומי דאוטריום בתמיסה 9, 10. חילופי בסיס-המזורז ב- pH הפיזיולוגי, עם-קטליזה חומצה הופכת נפוצה ב- pH מתחת כ 2.6. שער חליפין מבוסס על ארבעה גורמים עיקריים: pH, טמפרטורה, נגישות ממס מליטת מימן intramolecular. כמו שני הגורמים לשעבר נשמרים קבועים לאורך הניסוי, שער הדולר, במיוחד בתפקידים אמיד עמוד השדרה פפטיד, הוא בעיקר dependent על מבנה חלבון 11. בחוזקה אזורים מקופל עם נרחב, רשתות מליטת מימן יציבת סלילים-α ו β-sheets ייקח עד דאוטריום בשיעורים איטיים באופן משמעותי בהשוואת לולאות ואזורים מופרעים (ולפעמים בכלל לא) 12. זה מאפשר ניתוח חלבון הגלובלי, שבו הפרעות במבנה (למשל., על צבירה או מצע מחייב) להוביל שונים ספיג דאוטריום (איור 1).
מיקסר נימי הקינטית ניתן לשלב פלטפורמת microfluidic המכילה תא פרוטאוליטים עבור לוקליזציה של ספיגת דאוטריום. תא פרוטאוליטים זה מתקיים ב- pH הנמוך כדי להרוות את תגובת החליפין אפקטיבי, ומחייב פרוטאז חומצה משותק על מנת לעכל את החלבון לתוך פפטידים מקומיים (איור 2). ניטור חילופי עמוד השדרה בבית אלפית השנייה כדי קשקשים בפעם השנייה הוא חשוב במיוחד עבוראפיון של שינויים מרחביים בתוך קשה לאפיין אזורי לולאה, כדוריות מותכת, וחלבונים מופרעים מיסודם (עקורים) 13, 14. לחלופין, TRESI-HDX יכול לשמש גם כדי לאפיין חלבונים כי כרגע אין מבנה האטום לפתור באמצעות שיטות של קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו- NMR, באמצעות חילופי דאוטריום מצמידים את האלגוריתם קורקס (DX-קורקס) הגישה 15, 16. פרוטוקול מפורט זה יחול TRESI-HDX ללמוד טאו, גידול IDP, הן זה בצורה מקורית כמו גם זה מצב hyperphosphorylated פתוגניים. בעוד טאו ילידים הוא אחד העקור הנחקר ביותר היטב, מעט מאוד ידוע על עמיתו amyloidogenic שלה 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד שיטות ביולוגיה מבניות כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן ו- NMR הן יתרון משום שהם מספקים מבנים מפורטים מאוד של חלבונים, התמונות האלה הן בדרך כלל סטטי. האפיון של מינים חולפים תחומים מובנים בחולשה ממשיך להיות חמקמק כאשר למדו על ידי השיטות הקונבנציונליות הללו. לכן, …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.
Materials
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75µm, OD: 150µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga – 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
Referenzen
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
- Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization?. Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
- Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
- Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
- Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
- Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
- Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
- Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
- Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
- Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
- Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
- Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
- Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
- Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
- Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
- Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
- Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
- Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development – A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
- Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
- Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
- Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
- Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
- Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).
