Imágenes en vivo de la actividad antifúngica por los neutrófilos humanos primarios y los monocitos en respuesta a las<em> A. fumigatus</em

El protocolo para la obtención de neutrófilos y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se basa en los métodos publicados anteriormente 9. El uso de muestras de sangre de voluntarios sanos ha sido aprobado por el comité de ética de la investigación humana de la Universidad de Aberdeen. Antes de comenzar asegúrese de que todas las aprobaciones éticas están en su lugar para la extracción de sangre de voluntarios y / o pacientes sanos para el propósito del experimento descrito. Mantener las células en hielo cuando sea posible para aumentar su supervivencia. 1. A. fumigatus cultura y Condiciones Preparar medio de agar mínimo de glucosa como se describe 10. Ajuste de medios a pH 6,5 usando NaOH 1 M y autoclave a 120 ° C durante 20 min. Dejar enfriar a 65 ° C. Trabajando en una campana de flujo estéril, verter 30 ml de medio enfriadas en un matraz T75 y se deja enfriar con el cuello de la reclinación matraz en una pipeta de 25 ml a crear una pendiente de agar. Streak la cepa de A. fumigatus dsRed Af293- en el agar e incubar durante 7 días a 37 ° C + 5% de CO2. Dos frascos producirán aproximadamente 10 9 conidios en 5 solución salina tamponada con fosfato ml (PBS) pre-biotinilación. 2. A. fumigatus Etiquetado y Preparación Nota: Al realizar este ensayo, por primera vez, preparar el Af293- cepa de A. fumigatus parental. Tomar muestras de ambas cepas en tubos de microcentrífuga y la etiqueta de sólo una de cada cepa como se describe a continuación. Esto permitirá a uno tener conidios de control sin color y conidios con un solo color, ya sea dsRed o AF633, para probar la configuración y el equipo. Harvest A. fumigatus conidias sumergiendo el cultivo con 30 ml de PBS + 0,05% de Tween-80. Se filtra la suspensión resultante a través de un filtro de células de 40 m en un tubo de 50 ml para eliminar los fragmentos de hifas. doentrifuge a 805 xg durante 10 min, eliminar el sobrenadante y lavar una vez en 20 ml de PBS estéril. Piscina conidios a partir de dos placas de la misma cepa durante la etapa de lavado. Después de la etapa de lavado, resuspender el precipitado en 5 ml de PBS y la transferencia de alícuotas de 1 ml de la suspensión conidial en tubos de microcentrífuga. 1 ml de suspensión de cada cepa es generalmente suficiente para imágenes de células vivas. Envolver las alícuotas restantes en papel de aluminio y se almacenan a 4 ° C. alícuotas de centrífuga de suspensión de conidios a 9.300 xg durante 10 min a temperatura ambiente y cuidadosamente Extraer el sobrenadante. Resuspender el sedimento de conidios en 1 ml de 0,05 M de NaHCO3, pH 8,3. Preparar 10 mg de biotina / 200 dimetilsulfóxido l solución madre (DMSO) mediante la reconstitución de 25 mg de biotina en 500! L de DMSO. Añadir 10 l de biotina / DMSO solución madre al tubo de microcentrífuga, cubierta en papel de aluminio y se incuba durante 2 h en un agitador a 4 ° C. Alícuota el resto de la biotina / DMSO Stock solution y congelar a -20 ° C para su uso en experimentos posteriores. Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg y retirar con cuidado el sobrenadante. Resuspender el sedimento de conidios en 1 ml de 100 mM Tris-HCl pH 8,0 durante 1 h para desactivar biotina libre flotación. Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg y retirar con cuidado el sobrenadante. Lavar la pella dos veces con 1 ml de PBS estéril y resuspender el sedimento en 1 ml de PBS. Disolver 1 mg de estreptavidina-AF633 en 0,5 ml de PBS para hacer una solución madre de 2 mg / mL. Añadir 10? L de 2 mg / ml de estreptavidina-AF633 por 1 ml de suspensión conidial y se incuba durante 40 min a temperatura ambiente en un agitador cubierto de papel de aluminio. La estreptavidina-AF633 restante se puede congelar en alícuotas para su uso en experimentos posteriores. Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg y retirar con cuidado el sobrenadante. Resuspender el sedimento de conidios en 1 ml de PBS y contar el conidios usando un hemocitómetro en una dilución 1: 1000 (1: 100 y luego 1:10). Ajustar la concentración de conidios a 3,6 x 10 6 / ml con CO 2 medios de comunicación independientes, envolver en papel de aluminio y se almacenan a 4 ° C. NOTA: Los conidios son ahora etiquetados con AF633 y serán referidos como conidios bengala. Opcional: Si es necesaria la estimulación con conidios hinchado, después de contar conidios (paso 2.9), diluir conidios a 7,2 x 10 6 / ml en base nitrogenada de levadura (YNB) medio y añadir 500! L de suspensión conidial a 4,5 ml de medio YNB en un autoclave 50 matraz Erlenmeyer. Tapar y colocar el matraz en un incubador con agitación (200 rpm a 37 ° C) durante 6 h. Pasar el medio a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 805 xg durante 10 min a temperatura ambiente y lavar una vez en PBS. Centrifugar de nuevo y resuspender el sedimento en 1 ml CO 2 medio independiente, dando 3,6 x 10 6 conidios / ml. Nota: Las conidias se aglutinan con frecuencia después de que se hinchan haciendo precisa contar difícil, se aconseja para calcular la cnúmeros ounted de reposo conidios utilizados. 3. Aislamiento de neutrófilos y monocitos humanos Dibujar 20 ml de sangre venosa de voluntarios sanos en dos 10 tubos de sangre ml que contenían ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Para cada donante por separado, verter 20 ml de sangre en un tubo de 50 ml y se diluye con 15 ml de PBS. UNDERLAY la sangre con 15 ml de una solución de aislamiento de linfocitos (densidad 1,077 g / ml) con una aguja de jeringa y hierro. Coloque la aguja en la parte inferior del tubo y forzar suavemente la solución de aislamiento de linfocitos a cabo. Centrifugar a 630 xg durante 20 min sin freno y bajo aceleración. Preparar PBS, enfriado en hielo. NOTA: Los pasos 3.4 y 3.5 se debe seguir simultáneamente para generar monocitos (3.4) y neutrófilos (3.5). El uso de un pastette, cosechar la capa de PBMC. Esta es la capa en el centro entre el suero amarillo (superior) y la solución transparente de linfocitos aislamiento capa (inferior), ytransferir a un tubo nuevo 50 ml. Llenar el tubo con la PBMC hasta 50 ml con PBS frío y se centrifuga a 582 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y lavar dos veces con PBS frío y resuspender en 1 ml de PBS por 20 ml de sangre del donante utilizados inicialmente. Hacer diluciones 1:10 para contar mediante la adición de 20 l de la suspensión celular a 160 l de PBS y 20 l de azul de tripano. Recuento de células con un hemocitómetro. Preparar una solución tampón mediante la adición de 26 ml de suero inactivado por calor de ternera fetal (FCS) y 2,1 ml de 0,5 M EDTA a 500 ml de HBSS. Centrifugar las células durante 10 min a 515 xg y resuspender en 40 l de solución tampón por células 1 x 10 7. Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml y añadir 10 l de microperlas CD14 por las células 1 x 10 7, mezclar bien y se incuba durante 15 min a 4 ° C, asegurándose de mezclar los tubos de cada 5 min. Lavar las células mediante la adición de 1 ml de solución tampón por 1 x 10 7 células y CENtrifuge a 515 xg durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender completamente hasta 1 x 10 8 células en 500 l de solución tampón. Coloque la columna 1 por muestra en un separador magnético de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En primer lugar lavar la columna una vez con 500 l de solución tampón. Pipetear los 500 l de suspensión celular a través de la columna, esperar a que la columna se seque y luego lavar repitiendo esto tres veces con solución tampón. Colocar un nuevo tubo de 15 ml debajo de la columna y tomar la columna fuera del separador magnético. Luego enjuagar las células fuera de la columna en el tubo con 1 ml de solución tampón. Añadir 4 ml de solución tampón y se centrifuga a 515 xg durante 10 min, y luego volver a suspender en 1 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio. Hacer diluciones 1:10 para contar mediante la adición de 20 l de la suspensión celular a 160 l de PBS y 20 l de azul de tripano. Contar las células con unahemocitómetro. Ajustar la concentración de células a 6 x 10 5 / ml con RPMI y semilla de 200! L en un plato de formación de imágenes basada en vidrio 35 mm. Incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO2. Al día siguiente, antes de la imagen, eliminar el RPMI y añadir 200 l de CO 2 medio independiente. Nota: Estos monocitos también pueden diferenciarse en varios subconjuntos de macrófagos antes de la formación de imágenes. Si esta es una técnica para ser explorado, un excelente punto de partida es el reciente documento por Ohradanova-Repic et al. 1 1. Después de cosechar la capa de PBMC, eliminar todo el suero y la mayoría de la solución de aislamiento de linfocitos, pero tener cuidado de no eliminar la pequeña banda blanca en la parte superior de la pastilla roja como este contendrá la mayor parte de los neutrófilos. Preparar una reserva de estabilización 10x lisis hipotónica mediante la adición de 83 g de NH 4 Cl y 10 g de KHCO3 en 1 L de agua estéril. Almacenar a 4 °DO. Diluir esta 10x con agua estéril y añadirlo a los tubos. Luego, invierta cuidadosamente 3 veces y se incuban en hielo durante 15 min. Centrifugar a 394 xg durante 10 min y resuspender en tampón de lisis hipotónico durante 10 min en hielo. Centrifugar a 394 xg y lavar dos veces con PBS frío. Resuspender en 1 ml de CO 2 medio independiente por donante. Hacer diluciones 1:10 para contar mediante la adición de 20 l de la suspensión celular a 160 l de PBS y 20 l de azul de tripano. Contar las células con un hemocitómetro. Para citometría de flujo, ajustar la concentración a 6 x 10 5 / ml y añadir la suspensión de células 400! L a una placa de 24 pocillos. Para la microscopía, añadir 200 l de la misma suspensión celular a una placa de formación de imágenes basada en vidrio 35 mm. Nota: las imágenes de neutrófilos o citometría de flujo se debe iniciar inmediatamente debido a su propensión a sufrir apoptosis si se deja sin estimular. Si esto no es posible neutrófilos deben mantenerse enhielo y utilizado tan pronto como sea posible (dentro del mismo día). 4. Citometría de Flujo Añadir 200! L de 1,2 x 10 6 / conidios FLARE ml a las células en la placa de 24 pocillos, y a continuación, añadir 100 l de 20 mg / ml voriconazol. Añadir 300! L de RPMI y se incuba durante 16 h a 37 ° C con 5% de CO2. El voriconazol se añade para evitar la germinación de conidias: NOTA. Añadir 25 l de una solución madre 1 mM Calcofluor-blanco a cada pocillo para una concentración final de 25 mM y se incuba durante 10 min a 37 ° C con 5% de CO2. Centrifugar a 582 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y lavar dos veces con PBS. Para cosechar las células adherentes (monocitos), añadir 1 ml de PBS con EDTA 3 mM a cada pocillo y se incuba durante 10 min a 37 ° C con 5% de CO2. lavar suavemente las células de la placa por pipeteado y recoger las células en un tubo. Lavar una vez en tampón FACS (2% de suero de ternera fetal al PBS) y, a continuación, volver a suspender en tampón FACS para el análisis FACS. Para el análisis FACS, ajustar primero los parámetros de compensación del citómetro de flujo y establecer puertas positivos utilizando tubos de compensación de un solo color, incluyendo conidios sin color: dsRed + conidios, AF633 + conidios, y Calcofluor Blanco + conidios (generado como en 4.2). Establecer puerta de conidios libre basado en dispersión frontal y lateral con conidios sin color. Establecer puerta de celda de dispersión frontal y lateral mediante la exclusión de la puerta conidios libre. Analizar tubo de muestra mediante el registro de 10.000 eventos. Nota: las asociadas con conidios en directo se DsRed + y + AF633. Células asociadas con conidios muertos serán solamente AF633 +. células espectadoras que no han participado conidios será dsRed- y AF633-. Las poblaciones de células conidios-comprometido se analizan adicionalmente para la tinción Calcofluor blanco en el canal azul Pacífico. Conidios que quedan fuera de las células será Calcofluor blanco +, y conidios que se han internalizado seránCalcoflúor Blanco-. 5. vivo celular microscopía de vídeo Nota: La elección de microscopio dependerá de lo que está disponible a nivel local, pero la configuración microscopio necesitará incluir una fase invertida, una cámara ambiental calentada a 37 ° C y los filtros de excitación / emisión apropiados para dsRed (532/561 nm) y AF633 (633 nm). conidios FLARE no funcionan con el láser de 488 nm en lugar del láser 532/561 nm para dsRed. Al realizar este experimento para esta primera vez, utilizar los conidios de control sin color y el color único para la prueba de fluorescencia de fondo y sangrar a través entre el dsRed y canales AF633. Encender el calentador de microscopio antes del experimento y permitir tiempo suficiente para que la cámara de control del medio ambiente se caliente a 37 ° C. El tiempo necesario para temperatura de la cámara para estabilizar variará para diferentes configuraciones de microscopio. A su vez en el microscopio y el ordenador, y he aquíanuncio del software de imágenes. Montar el plato de imagen en la platina del microscopio y ajustar el enfoque para encontrar los neutrófilos o monocitos humanos. Para dsRed y AF633, establecer la potencia del láser para el 10% y el tiempo de exposición a 1 s en la configuración de adquisición. Retire la corredera de formación de imágenes y añadir 100 l de 3 x 10 6 / ml FLARE suspensión de conidios a los pocillos apropiados (volumen total 300! L / pocillo). Registre el tiempo que estallan conidios se añaden al plato. Devolver el carro a la escena y ajustar la sensibilidad de la cámara para dsRed y AF633 de ver con claridad los conidios pero no sobreexponer la imagen. Configurar una lista de puntos de etapa si se requiere la adquisición de múltiples puntos. Comenzar la formación de imágenes cuando todos los puntos están en foco, los canales están optimizadas y se establece el tiempo de ciclo y la duración. El tiempo del ciclo y la duración de las imágenes dependen de la cuestión experimental. El objetivo es mantener el tiempo de ciclo lo más corto posible (≤2 min) con 1 min permitiendo un análisis en profundidad de UPTake dinámica.