에 대한 응답으로 인간의 기본 호중구와 단핵구에 의해 항진균 활성의 라이브 영상<em>를했다. 투스</em

호중구 및 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)를 얻는 프로토콜은 이전에 발행 된 방법 (9)에 기초한다. 건강한 지원자에서 혈액 샘플의 사용은 애버딘 대학의 인간 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 시작하는 것이 있는지 확인하기 전에 모든 윤리적 승인은 설명 실험의 목적을 위해 건강한 지원자 및 / 또는 환자에서 혈액을 그리기 위해 자리에 있습니다. 자신의 생존을 증가시킬 수 얼음에 세포를 유지합니다. 1. A. fumigatus에 문화 약관 10 바와 같이 글루코스 최소 한천 배지를 준비한다. 20 분 동안 120 ° C에서 1 M의 NaOH를 이용하여 pH를 6.5 오토 클레이브에 미디어를 조정한다. 65 ℃로 냉각시킵니다. 무균 유동 후드에서 작업하는 T75 플라스크에 냉각 매체 30 ㎖를 붓고 C로 25 ㎖ 피펫을 쉬고 플라스크의 목 식히한천 기울기를 reate. 한천의 Af293-을 DsRed A. 푸 미가 투스의 균주 아웃 킬 및 37 ° C + 5 % CO 2에서 7 일간 배양한다. 두 플라스크를 5 ㎖의 인산 완충 식염수 (PBS) 프리 바이오 틸 약 109 분생 포자를 생성한다. 2. A. fumigatus에 라벨링 제조 참고 : 처음으로 상기 분석을 수행 할 때, 보호자 Af293- A. 푸 미가 투스의 변형을 준비한다. 마이크로 원심 튜브에 두 균주의 샘플을 채취하고 후술하는 바와 같이 각 균주의 한 라벨. 이것은 설치 및 장비를 테스트하기 위해,을 DsRed 또는 AF633 중 하나는 단일 색상으로 어떤 색상과 분생 포자로 제어 분생 포자를 할 수 있습니다. 30 mL의 PBS + 0.05 % 트윈 80과 함께 배양하여 수확 침지 된 A. 푸 미가 투스의 분생. 균사 단편을 제거하기 위해 50 ㎖ 튜브에 40 μm의 세포 여과기를 통해 생성 된 현탁액을 여과. 기음10 분 동안 805 XG에 entrifuge 상등액을 제거하고 멸균 PBS 20 mL로 한번 세척 하였다. 세척 단계 동안 동일한 두 균주의 플레이트에서 풀 분생. 세정 공정 후, PBS 5ml에 펠릿 전사 마이크로 원심 튜브에 포자 현탁액을 1 mL의 분취 량을 재현 탁. 각 균주의 현탁액 1 ㎖ 보통 생균 촬상 충분하다. 4 ℃에서 저장 포일의 나머지 분취 량을 감싸. 포자 현탁액을 원심 분리기 분획을 실온에서 10 분 동안 9,300 XG에 조심스럽게 상층 액을 제거한다. 0.05 mL의 1 M NaHCO3을 pH가 8.3 포자 펠렛을 재현 탁. 500 μL DMSO에 25 mg의 비오틴을 재구성하여 10 mg의 비오틴 / 200 μL의 디메틸 술폭 시드 (DMSO) 스톡 용액을 준비한다. 알루미늄 박에 10 μL 비오틴 /를 마이크로 원심 튜브에 DMSO 원액 커버를 추가하고 4 ℃에서 로커에서 2 시간 동안 배양한다. 비오틴 / DMSO의 주식 solutio의 나머지 부분을 나누어지는n은 이후 실험에 사용 -20 ° C에서 동결. 9,300 XG에서 10 분 동안 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 부동성 비오틴을 비활성화 한 시간 동안의 pH 8.0의 100 mM 트리스 염산 1 ㎖의 포자 펠렛을 재현 탁. 9,300 XG에서 10 분 동안 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 멸균 PBS 1 ml로 두 번 세척하고 펠렛을 PBS 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 2 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을하기 위해 PBS를 0.5 mL의 스트렙 타비 딘 – AF633 1mg을 녹인다. 포자 현탁액 1 ㎖ 당 2 ㎎ / ㎖ 스트렙 타비 딘 – AF633의 10 μL를 추가하고 알루미늄 호일로 덮여 로커에 실온에서 40 분 동안 배양한다. 나머지 스트렙 타비 딘-AF633 후속 실험에 사용 씩 동결 할 수 있습니다. 9,300 XG에서 10 분 동안 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 제거. PBS 1 ㎖에 포자 펠렛을 재현 탁하고, 1의 혈구를 사용하여 분생 포자를 카운트 : 1000 희석 (1 : 100 다음 1시 10분). , CO 3.6 × 106 / ㎖로 2 독립 미디어를 포자 농도를 조정하여 4 ℃에서 저장 포일에 감싸. 참고 : 분생 포자 지금 AF633으로 표시하고 FLARE의 분생 포자로 언급 될 것이다. 선택적 : 팽윤 분생 자극이 필요한 경우, 분생 포자를한다 (단계 2.9) 계산 한 후, 효모 질소 기재 7.2 × 106 / ㎖로 (YNB) 매체 분생 희석하고 50 멸균 4.5 ㎖의 YNB 배지 500 μL 포자 현탁액을 추가 ML 에를렌마이어. 커버, 6 시간 동안 진탕 배양기 (37 ℃에서 200 rpm으로)에 플라스크를 배치했다. 15 ㎖의 튜브에 매체를 옮긴다. 실온에서 10 분 동안 원심 분리기 (805) XG하고 PBS로 한번 세척 하였다. 1 mL의 CO에서 다시 원심 분리하고 재현 탁 된 펠릿을 3.6 × 106 분생 포자 / ㎖을주는 2 독립 매체. 참고 : 정확한 어려운 계산하게 팽창되어 후에 분생 포자가 자주 응집, C로 계산하는 것이 좋습니다사용 분생 포자 휴식의 ounted 번호. 인간 호중구 3. 격리 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 함유하는 2 개 개의 10 mL의 혈액 튜브에 정상인으로부터 정맥혈을 20㎖을 그린다. 별도로 각 도너를 들어, 50 ㎖ 튜브에서 20 mL의 혈액을 붓고, 15 mL의 PBS로 희석 하였다. 주사기 바늘 철 림프구 분리 용액 (밀도 1.077 g / mL)을 15 mL의 혈액을 언더. 상기 튜브의 하단에 바늘을 넣고 부드럽게 림프구 분리 용액을 강제. 브레이크없이 낮은 가속도로 20 분 동안 원심 분리기 (630) XG. PBS, 얼음에 냉장을 준비합니다. 주 : 3.4 단계 3.5는 단핵 세포 (3.4) 및 호중구 (3.5)를 생성하는 동시에 따라야한다. pastette를 사용하여 PBMC 층을 수확. 이 옐로우 혈청 (위)과 투명 림프구 분리 용액 (하부) 층 사이의 중심에있는 층이며신선한 50 ㎖ 튜브로 옮긴다. 10 분 동안 582 XG에 차가운 PBS 50 mL로 원심 분리와의 PBMC와 관을 채운다. 상등액을 제거하고 초기에 사용 된 공여체의 혈액 20 ㎖ 당 PBS 1 ㎖에 재현 탁하고 차가운 PBS로 두 번 세척 하였다. PBS 160 μL 및 트리 판 블루 20 μL에 세포 현탁액 20 μL를 첨가하여 계산 1:10 희석액을 만든다. 혈구와 세포를 계산합니다. 열 불 활성화 소 태아 혈청 (FCS) 및 HBSS 500 mL의 0.5 M EDTA 2.1 mL를 26 mL의 첨가에 의해 완충 용액을 준비한다. 1 × 107 세포 당 완충액 40 μL에 10 분 515 XG에 재현 탁하고 세포를위한 원심 분리기. 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 1 × 107 세포 당 CD14 마이크로 비드의 10 μL를 추가하고, 잘 혼합하고 5 분마다 튜브를 혼합하는 확인하면서 4 ° C에서 15 분 동안 배양한다. 1 × 107 개 세포 당 CEN 완충액 1 ㎖를 첨가하여 세포를 씻어10 분 동안 515 XG에 trifuge. 대기음 상등액 완전히 완충액 500 μL에 1 × 10 개 8 세포를 재현 탁. 제조자의 지시에 따른 자기 분리기 샘플 당 1 열에 배치. 제 1 버퍼 용액 500 μL 회 칼럼을 세척 하였다. 상기 컬럼을 통해 세포 현탁액 500 μL 피펫 건조 열 기다렸다가 완충액이 세 번 반복하여 세척 하였다. 컬럼 아래 새로운 15ml의 튜브를 배치하고 자기 분리기로부터 떨어져서 열을 받아. 그 다음 완충 용액 1 mL를 상기 튜브로 열 중에서 세포를 세척. 10 분 동안 515 XG에 완충액에서 원심 분리 4 mL를 첨가 한 다음 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 배지 1 ㎖에 재현 탁. PBS 160 μL 및 트리 판 블루 20 μL에 세포 현탁액 20 μL를 첨가하여 계산 1:10 희석액을 만든다. A의 세포를 계산혈구. RPMI 6 × 105 / ㎖로 세포 농도를 조정하고, 35mm 유리 기반 이미징 접시에 200 μL 시드. 5 % CO 2와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션. 다음 날, 영상에 앞서, RPMI를 제거하고 CO 2 독립적 인 매체의 200 μL를 추가합니다. 참고 :이 단핵구도 이전 영상에 다양한 대식 세포 하위 집합으로 구분 될 수있다. 이 탐험하는 기술이라면, 훌륭한 출발점이 Ohradanova-Repic 등에 의한 최근의 논문입니다. 1 1. PBMC 층을 수확 한 후 혈청을 모두 제거하고 림프구 분리 솔루션의 대부분,하지만이 호중구의 대부분을 포함로 붉은 펠렛의 상단에 작은 흰색 밴드를 제거하지 않도록주의. NH 4 CL 83 g 및 멸균 물 1 L에 KHCO 3 10 g을 첨가하여 10 개 배 저장성 용해 완충액 재고를 준비한다. 4 °에서 보관기음. 멸균 물이 주식의 10 배를 희석하여 튜브에 추가합니다. 그런 다음, 조심스럽게 3 번 반전하고 15 분 동안 얼음에 품어. 얼음에서 10 분 동안 저장성 용해 완충액에 재현 탁하고 10 분간 394 XG 원심 분리기. 394 XG에 원심 분리기 차가운 PBS로 두 번 씻는다. 도너 당 CO 2 독립 배지 1 ㎖에 재현 탁. PBS 160 μL 및 트리 판 블루 20 μL에 세포 현탁액 20 μL를 첨가하여 계산 1:10 희석액을 만든다. 혈구와 세포를 계산합니다. 유동 세포 계측법, 6 × 105 / mL의 농도를 조정하고, 24 웰 플레이트에 400 μL의 세포 현탁액을 추가한다. 현미경 들어 35mm 유리 기반 이미징 접시에 동일한 세포 현탁액을 200 μL를 추가한다. 호중구 영상 또는 자극받지 않은 떠나는 경우에 세포 사멸을 받아야하는 그들의 성향에 즉시 시작되어야 유동 세포 계측법 :합니다. 이없는 경우 가능한 호중구에 보관해야합니다얼음과 (같은 날 내에서) 가능한 한 빨리 사용. 4. 유동 세포 계측법 24 웰 플레이트에서 세포를 1.2 × 10 6 / ㎖ 플레어 분생 200 μL를 추가 한 다음, 20 ㎍ / mL의 보리 코나 졸의 100 μL를 추가한다. RPMI 300 μL를 첨가하고, 5 % CO 2, 37 ℃에서 16 시간 동안 배양한다. 참고 : 보리 코나 졸은 분생 포자 발아를 방지하기 위해 추가됩니다. 25 μM의 최종 농도로 각 웰에 1 mM의 CALCOFLUOR 백색 스톡 용액 25 μL를 첨가하고, 5 % CO 2, 37 ℃에서 10 분 동안 배양한다. 10 분 동안 582 XG 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 PBS로 두 번 씻는다. 부착 세포 (단핵구)을 수확하기 위해, 각 웰을 3 mM의 EDTA PBS로 1 mL를 첨가하고, 5 % CO 2, 37 ℃에서 10 분 동안 배양한다. 조심스럽게 튜브에 세포를 피펫 팅하여 세포 플레이트 오프 씻어 모은다. PB에 FACS 버퍼에 한 번 세척 (2 % 소 태아 혈청S)은 다음 FACS 분석 FACS 완충액에 재현 탁. FACS 분석의 경우, 제 사이토 유량의 보정 파라미터를 조정없이 색상 분생 포함 단색 보상 튜브를 이용한 포지티브 게이트 설정 :을 DsRed +의 분생, AF633 + 분생 및 CALCOFLUOR 화이트 +의 분생 (4.2로서 생성을). 설정 무료 분생 포자 게이트 앞으로 기반 및 측면 산란이없는 색상 분생 포자를 사용하여. 자유 분생 게이트를 제외한 전방 및 측면 스 캐터에 게이트 셀을 설정한다. 10000 개 이벤트를 기록하여 샘플 튜브를 분석합니다. 참고 : 라이브 분생 포자와 관련된 세포 + 및 AF633 +를을 DsRed됩니다. 죽은 분생 포자와 관련된 세포 AF633 +에게 유일한 것입니다. dsRed- 및 AF633- 될 것 분생 포자를 종사하지 않은 방관자 세포. 생포 – 결합 세포 집단은 상기 퍼시픽 블루 채널 CALCOFLUOR 화이트 염색에 대해 분석한다. 내면화 된 CALCOFLUOR 화이트 +됩니다 세포의 외부 남아 분생 포자와 분생 포자가 될 것입니다CALCOFLUOR 화이트 -. 5. 라이브 셀 비디오 현미경 현미경의 선택은 로컬에 무엇에 의존하지만, 현미경 설치 반전 단계는 DsRed (561분의 532 ㎚) 및 AF633 37 ° C 적절한 여기 / 발광 필터로 가열 환경 챔버를 포함 할 필요가 참고 (633 ㎚). FLARE 분생 포자는을 DsRed의 561분의 532 nm의 레이저 대신 488 nm의 레이저 작동하지 않습니다. 이 처음으로이 실험을 수행 할 때, 배경 형광에 대한 테스트를 통해 블리드을 DsRed AF633와 채널 사이에 아무런 색상 단일 색상 제어 분생 포자를 사용한다. 실험에 앞서 현미경 히터를 켜고 환경 제어 챔버는 37 ° C로 예열을위한 충분한 시간을 허용합니다. 안정화 챔버 온도 걸리는 시간은 다른 현미경 설정에 따라 다를 것입니다. 현미경과 컴퓨터, 보라를 켜십시오광고 이미징 소프트웨어. 현미경 단계에있는 이미징 접시를 탑재하고 인간 호중구 또는 단핵구를 찾기 위해 초점을 조정합니다. 을 DsRed 및 AF633 들어, 인수 설정에서 1 초에 10 % 및 노출 시간에 레이저 파워를 설정. 촬상 슬라이드를 제거하고 100 μL를 추가 3 × 106 / mL의 FLARE 적절한 웰에 포자 현탁액 (총 부피 300 μL / 웰). 분생 포자가 접시에 추가됩니다 FLARE 시간을 기록한다. 무대에 슬라이드를 반환하고 명확하게 분생 포자를 볼 수 있지만 이미지를 과다하지 않도록을 DsRed 및 AF633에 대한 카메라의 감도를 조정합니다. 멀티 포인트 획득이 필요한 경우 무대 지점 목록을 설정합니다. 모든 점에 초점이 때, 채널 최적화하고 사이클 시간과 기간을 설정 이미징 시작. 사이클 시간과 영상의 기간은 실험 질문에 따라 달라집니다. 목표는 1 분 UPT 심층 분석에서 허용 가능한 짧게 (≤2 분), 사이클 시간을 유지하는 것아케 역학.