Cevabı İnsan İlköğretim nötrofiller ve monositler tarafından Antifungal Faaliyet Canlı Görüntüleme<em> A. fumigatus</em

Nötrofiller ve periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) elde etmek için protokol, önceden yayımlanan metotlardan 9 dayanmaktadır. Sağlıklı gönüllülerden alınan kan örnekleri kullanılması Aberdeen Üniversitesi İnsan araştırma etik komitesi tarafından onaylandı. başlamadan önce şunlara dikkat edin bütün etik onayları açıklanan deney amacıyla sağlıklı gönüllüler ve / veya hastalardan kan çizmek için yerinde bulunmaktadır. onların hayatta artırmak mümkün hücreleri buz üzerinde tutun. 1. A.fumigatus Kültür ve Koşullar Tarif edildiği gibi 10 glikoz minimal agar ortamı hazırlar. 20 dakika boyunca 120 ° C de, 1 M NaOH ile pH 6.5 ve otoklava ortamı ayarlayın. 65 ° C'ye kadar soğumaya bırakılır. bir steril akış başlığı içinde çalışarak, T75 şişesi içine soğutulmuş ortamı 30 mL dökün ve c 25 ml'lik bir pipetle üzerinde akıtma dinlenme boynuna soğumaya bırakınBir agar eğim REATE. Agar üzerine DsRed Af293- A. fumigatus soyu üzerinden leke yapmayan ve 37 ° C ile + 5% CO2 7 gün boyunca inkübe edilir. İki tüp 5 ml fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ön-biyotinilasyon yaklaşık 10 9 konıdi verecektir. 2. A. fumigatus Etiketleme ve Hazırlama Not: ilk kez bu tahlili yaparken, ebeveyn Af293- A. fumigatus suşu hazırlar. mikrosantrifüj tüpleri içinde, her iki suşların örnekleri almak ve aşağıda tarif edildiği gibi, sadece her bir suşun bir etiket. Bu kurulum ve ekipmanı test etmek, dsRed veya AF633 ya, tek tek renk ile hiçbir renk ve conidia kontrol konidianıri sahip sağlayacaktır. 30 ml PBS +% 0.05 Tween-80 ile kültür daldırarak Hasat A. fumigatus conidia. Hif fragmanlarını temizlemek amacıyla, bir 50 ml tüp içine, bir 40 um'lik bir hücre süzgecinden Elde edilen süspansiyon süzülür. C10 dakika boyunca 805 x g'de entrifuge süpernatant kaldırmak ve steril PBS'nin 20 mL kez yıkayın. Yıkama aşaması sırasında aynı türden iki plakalardan Havuz conidia. Yıkama adımından sonra, 5 ml PBS pelet ve transfer mikrosantrifüj tüpleri içine konidial süspansiyon 1 ml'lik eş payları yeniden süspanse edin. Her cinsin süspansiyonu 1 ml genellikle canlı hücre görüntüleme için yeterlidir. 4 ° C 'de folyo ve deposunda kalan alikotları sarın. konidial süspansiyon santrifüj alikoları, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 9,300 x g'de ve dikkatli bir şekilde süpernatant kaldırmak. 1 ml 0.05 M NaHCOs 3, pH 8.3 konidial pelletini. 500 uL DMSO içinde 25 mg biyotin yeniden oluşturulması ile 10 mg biyotin / 200 uL dimetilsülfoksit (DMSO) bir stok çözelti hazırlayın. alüminyum folyo ile 10 uL biyotin / mikrosantrifüj tüpüne DMSO stok çözeltisi, kapak ekleyin ve 4 ° C'de bir sallama düzeneği üzerinde 2 saat süreyle inkübe edin. biyotin / DMSO stok çözeltideki kalanını alikosuburada n ve sonraki deneylerde kullanılmak üzere -20 ° C'de dondurun. 9,300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant kaldırmak. serbest yüzen biyotin devre dışı bırakmak için, 1 saat boyunca, pH 8.0, 100 mM Tris-HCl, 1 mL konidial pelletini. 9,300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant kaldırmak. Steril 1 mL PBS ile iki kez yıkanır ve pelet 1 mL PBS içinde pelletini. 2 mg / mL stok çözelti yapmak için PBS 0.5 mL streptavidin-AF633 1 mg çözülür. konidial süspansiyon 1 mL başına 2 mg / ml streptavidin AF633 10 uL ekleyin ve alüminyum folyo ile kaplı bir rocker, oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edilir. Kalan Streptavidin AF633 sonraki deneylerde kullanılmak üzere alikolar içinde dondurulabilir. 9,300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant kaldırmak. 1 mL PBS içinde konidial pelletini ve 1 bir hemasitometre kullanarak konıdi sayısı: 1000 seyreltme (1: 100 ve daha sonra 1:10). CO ile 3.6 x 10 6 / mL 2 bağımsız ortamı konidial konsantrasyonu ayarlama, 4 ° C 'de folyo ve mağaza sarın. NOT: conidia şimdi AF633 ile etiketlenir ve FLARE Konidyumların olarak anılacaktır. İsteğe bağlı: şişmiş conidia uyarma gerekli ise, konıdi (adım 2.9) sayıldıktan sonra, maya azot baz içinde 7.2 x 10 6 / mL (YNB) orta konıdi sulandırın ve bir 50 otoklava 4.5 ml YNB ortamına 500 uL konidial süspansiyon eklemek mL Erlenmeyer şişesine. Kapak ve 6 saat boyunca bir çalkalama inkübatöründe (37 ° C'de 200 rpm) içine yerleştirilir. bir 15 ml tüp orta aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 805 x g'de santrifüj edildi ve PBS içinde bir kez yıkayın. 1 ml CO tekrar santrifüj ve tekrar süspansiyon pelet 3.6 x 10 6 conidia / ml veren 2 bağımsız ortam. Not: Doğru zor sayım yapma şişmiş olduktan sonra Konidyumlar sık simlenirler o c hesaplamak için tavsiye edilirkullanılan konidyayı dinlenme ounted sayıları. İnsan nötrofil ve monositlerin 3. İzolasyon etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden 10 mL'lik iki kan tüplerine sağlıklı gönüllülerden venöz kan 20 mL çizin. ayrı ayrı her bir donör, bir 50 ml tüp içinde 20 ml kan dökün ve 15 ml PBS ile seyreltilir. bir şırınga ve demir iğne ile lenfosit izolasyonu çözeltisi (yoğunluk 1.077 g / ml), 15 mL kan altına koymak. Tüpün alt kısmında iğne yerleştirilir ve hafifçe lenfosit izolasyonu çözüm zorlar. bir fren ve düşük bir ivme ile 20 dakika boyunca 630 x g'de santrifüjleyin. PBS, buz üzerinde soğutulmuş hazırlayın. NOT: 3.4 Adımları ve 3.5 monositleri (3.4) ve nötrofil (3.5) üretmek için eşzamanlı takip edilmelidir. Bir pastette kullanarak, Hücre katmanı hasat. Bu san serumu (üst) ve şeffaf bir lenfosit izolasyonu çözeltisi (alt) tabakası arasında merkezi bir tabakadır veyeni bir 50 mL tüp içine aktarılır. 10 dakika boyunca 582 x g'de 50 soğuk PBS ile mL santrifüj PBMC ile tüp doldurun. Süpernatantı ve başlangıçta kullanılan verici kanı 20 mL başına 1 mL PBS içinde soğuk PBS ve tekrar süspansiyon ile iki kez yıkanır. PBS 160 uL ve tripan mavisi 20 uL hücre süspansiyonu 20 uL eklenmesiyle sayım 1:10 dilüsyonları yapılır. Bir hemasitometre ile hücre sayımı. ısı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS) ve HBSS, 500 mL, 0.5 M EDTA, 2.1 mL 26 ml ilave edilerek bir tampon çözeltisi hazırlayın. 1 x 10 7 hücre başına tampon solüsyonu 40 uL, 10 515 x g'de dakika ve tekrar süspansiyon hücreleri santrifüjleyin. 15 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın ve 1 x 10 7 hücre başına CD14 mikro boncuklar 10 uL eklenir, iyice karıştırılır ve her 5 dakikada bir tüpler karıştırmak için emin, 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. 1 x 10 7 hücreleri ve cen başına tampon çözeltisi 1 mL eklenerek hücreler yıkanır10 dakika boyunca 515 x g'de trifuge. Aspire süpernatantı tamamen ve tampon çözeltisinin 500 uL kadar x 01-10 Ağustos hücreleri tekrar süspansiyon. üreticinin talimatlarına göre bir manyetik ayırıcı numune başına 1 sütun yerleştirin. Birinci tampon çözeltisi 500 uL ile bir kez kolon yıkayın. , Kolon boyunca hücre süspansiyonu 500 ul pipet kuru sütun bekleyin ve tampon çözeltisi ile üç kez tekrarlayarak yıkayın. sütununun altında yeni bir 15 ml tüp yerleştirilir ve manyetik ayırıcı kapalı sütun alır. Daha sonra tampon çözeltisi 1 mL tüp içine sütunun üzerinden hücreleri yıkayın. 10 dakika boyunca 515 x g'de tampon çözeltisi ve santrifüj 4 mL ekleyin ve sonra Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamında, 1 mL de yeniden süspanse edin. PBS 160 uL ve tripan mavisi 20 uL hücre süspansiyonu 20 uL eklenmesiyle sayım 1:10 dilüsyonları yapılır. bir ile hücre sayımıhemositometre. RPMI 6 x 10 5 / mL hücre konsantrasyonuna ayarlamak ve 35 mm cam tabanlı görüntüleme tabağına 200 uL tohum. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün, görüntü vermeden önce, RPMI kaldırıp CO 2 bağımsız ortamın 200 uL ekleyebilir. Not: Bu monositler de önce görüntüleme çeşitli makrofaj alt kümeleri içine ayırt edilebilir. Bu keşfedilmeyi bir tekniktir ise, mükemmel bir başlangıç noktası Ohradanova-Repic ark son kağıdıdır. 1 1. Hücre katmanı hasat sonrasında serum tümünü kaldırmak ve lenfosit izolasyonu çözümün en, ancak bu nötrofillerin en içerecektir kırmızı topağı üzerine küçük beyaz bant kaldırmak için dikkatli olun. NH4CI 83 g ve steril 1 L su içinde KHCO 3 10 g eklenerek 10x hipotonik lizis tampon stok hazırlayın. 4 ° 'de saklayınC. steril su ile bu stok 10x seyreltin ve tüpler ekleyin. Sonra, dikkatle 3 kez ters ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe. buz içinde 10 dk için hipotonik liziz tamponu içinde 10 dakika ve tekrar süspansiyon için 394 x g'de santrifüjleyin. 394 x g'de santrifüj ve soğuk PBS ile iki kez yıkanır. Donör başına CO2 bağımsız orta 1 mL içinde süspanse edin. PBS 160 uL ve tripan mavisi 20 uL hücre süspansiyonu 20 uL eklenmesiyle sayım 1:10 dilüsyonları yapılır. Bir hemasitometre ile hücre sayımı. Akış sitometrisi için 6 x 10 5 / mL konsantrasyonu ayarlamak ve 24 gözlü bir levhaya 400 uL hücre süspansiyonu ekleyin. mikroskopi için, 35 mm cam tabanlı görüntüleme çanak aynı hücre süspansiyonu 200 uL ekleyin. Nötrofil görüntüleme veya uyarılmamış bırakılırsa apoptosise maruz nedeniyle eğilimi hemen başlatılmalıdır akış sitometrisi: unutmayın. Bu değilse olası nötrofiller üzerinde tutulmalıdırBuz ve (aynı gün içinde) en kısa zamanda kullanılır. 4. Akış Sitometri 24 gözlü filtre plakasının içindeki hücrelere, 1.2 x 10 6 / ml FLARE conidia 200 uL ekleyin ve daha sonra 20 ug / mL, vorikonazol, 100 uL ilave edin. RPMI 300 uL ilave edin ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 16 saat boyunca inkübe edilir. NOT: Vorikonazol Konidıal çimlenmeyi önlemek için eklenir. 25 uM'lik bir son konsantrasyon için, her bir kuyucuğa 1 mM Kalkofluor beyaz stok solüsyonu 25 uL ekleyin ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 10 dakika süre ile inkübe edilir. 10 dakika boyunca 582 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı ve PBS ile iki kez yıkayın. Yapışkan hücreler (monositler) hasat etmek için, her bir göze, 3 mM EDTA içeren PBS içinde 1 ml ilave edilir ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 10 dakika süre ile inkübe edilir. Yavaşça bir tüp içinde hücreleri pipetleme plaka kapalı hücreleri yıkayın ve toplayın. PB FACS tamponunda bir kez yıkayın (% 2 cenin dana serumuS) ve daha sonra FACS analizi için FACS tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. FACS analizi için, ilk akış sitometresi dengeleme parametrelerini ayarlamak ve bir renk ile konidia içeren tek renkli dengeleme boruları kullanılarak pozitif kapıları, set: DsRed + conidia, AF633 + conidia ve Kalkofluor Beyazı + conidia (4.2 gibi üretilen). Set serbest conidia kapısı ileri dayanan ve yan dağılım hiçbir renk ile konidyayı kullanarak. ücretsiz conidia kapısı hariç tutarak ön ve yan saçılma üzerine hücre kapısı ayarlayın. 10.000 olayları kaydederek örnek tüp analiz edin. NOT: Canlı Konidyumların ilişkili Hücreler + ve AF633 + dsRed edilecektir. Ölü Konidyumların ile ilişkili hücreler AF633 + sadece olacaktır. dsRed- ve AF633- olacak konidianıri meşgul değil Bystander hücreleri. conidia-yapan hücre popülasyonlan, Pasifik Mavi kanalında Kalkofluor Beyazı boyama için analiz edilir. içselleştirilmiş olan Kalkoflor Beyaz + olacak hücrelerinin dışında kalan Konidyumlar ve Konidyumların olacakKalkoflor Beyaz-. 5. Canlı Hücre video Mikroskopi Mikroskop seçimi yerel olarak mevcut ne bağlı olacaktır, ancak bir mikroskop kurulum, ters evre, DsRed (532/561 nm) ve AF633 için 37 ° C ve uygun uyarım / emisyon filtreleri ısıtılmış bir kazanı dahil etmek gerekir: Not (633 nm). FLARE konıdı dsRed için 532/561 nm lazer yerine 488 nm lazer ile çalışmaz. Bu ilk kez bu deney yaparken, dip fluor ışıması bakımından test taşmasını DsRed ve AF633 kanallar arasında hiçbir renk ve tek bir renk ile kontrol konıdi kullanın. Deney öncesi bir mikroskop ısıtıcı açın ve çevresel kontrol bölmesi 37 ° C ye ısınmasına için yeterli bir süre sağlar. stabilize edilmesi için bir oda sıcaklığı için geçen zaman, farklı mikroskop kurulumları için değişecektir. Mikroskop ve bilgisayar ve lo açınreklam görüntüleme yazılımı. Mikroskop sahnede görüntüleme tabak monte ve insan nötrofil veya monositleri bulmak için odağı ayarlayın. dsRed ve AF633 için, edinim ayarlarında 1 s% 10 ve maruz kalma süresine lazer gücü ayarlayın. Görüntüleme slayt çıkarın ve 100 uL ilave 3 x 10 6 / ml FLARE uygun kuyulara konidial süspansiyon (toplam hacim 300 uL / oyuk). Konidyumların dişe eklenir fişeği süresi olarak kaydedilir. sahneye slayt dönün ve açıkça konidianıri görüyor ancak görüntüyü overexpose değil dsRed ve AF633 için kamera hassasiyetini ayarlayın. Çok noktalı edinimi gerekiyorsa bir sahne noktaları listesi oluşturun. Tüm noktalar odakta olduğunda, kanallar optimize edilmiştir ve döngü süresi ve süresi ayarlanır görüntüleme başlayın. Çevrim süresi ve görüntüleme süresi deneysel soruya bağlıdır. hedef 1 dakika ŞTT derinlemesine analiz için izin mümkün olan en kısa (≤2 dakika) çevrim süresini tutmaktırAKE dinamiği.