Aquí, se describe un protocolo para evaluar la actividad antifúngica de las células inmunes humanas primarias en tiempo real utilizando fluorescente conidias de Aspergillus reportero en conjunción con microscopía de vídeo en vivo de células y citometría de flujo. Los datos generados proporcionan la penetración en hospedantes de célula interacciones de Aspergillus tales como actividad fungicida, la fagocitosis, la migración celular y la inhibición de crecimiento de hongos.
Aspergillus fumigatus es un patógeno oportunista por hongos que causan infecciones invasivas en huéspedes inmunocomprometidos con una alta tasa de letalidad. Investigación investigar las respuestas inmunológicas contra de A. fumigatus se ha limitado por la falta de ensayos consistentes y fiables para medir la actividad antifúngica de las células inmunes específicas in vitro. Un nuevo método se describe para evaluar la actividad antifúngica de los monocitos primarios y los neutrófilos de donantes humanos contra A. fumigatus utilizando fluorescentes Aspergillus reportero conidios (FLARE). Estos conidios contienen un reportero dsRed codificado genéticamente, que se expresa de forma constitutiva por conidios FLARE en vivo, y están etiquetados externamente con Alexa Fluor 633, que es resistente a la degradación dentro del fagolisosoma, permitiendo así una distinción entre conidios A. fumigatus viva y muerta. video microscopía y citometría de flujo se utilizan posteriormente para visualizar el interactúanion entre conidios y las células inmunes innatas, la evaluación de la actividad fungicida mientras que proporciona también una gran cantidad de información sobre la migración de fagocitos, la fagocitosis y la inhibición de crecimiento de hongos. Esta nueva técnica ha proporcionado ya emocionantes nuevos conocimientos sobre la interacción huésped-patógeno de células inmunes primarios contra A. fumigatus. Es importante tener en cuenta la configuración de laboratorio necesario para realizar este ensayo, incluyendo la microscopía y citometría de flujo necesaria instalaciones, y la capacidad de trabajar con sangre de donantes humanos y hongos manipulados genéticamente. Sin embargo, este ensayo es capaz de generar grandes cantidades de datos y puede revelar información detallada de la la respuesta antifúngico. Este protocolo ha utilizado con éxito para estudiar la interacción huésped-patógeno de células inmunes primarios contra A. fumigatus.
Es importante tener en cuenta la configuración de laboratorio necesario para realizar este ensayo, incluyendo la microscopía y citometría de flujo necesaria facilities, y la capacidad de trabajar con sangre de donante humano y hongos manipuladas genéticamente. Sin embargo, este ensayo es capaz de generar grandes cantidades de datos y puede revelar información detallada de la la respuesta antifúngico. Este protocolo ha utilizado con éxito para estudiar la interacción huésped-patógeno de células inmunes primarios contra A. fumigatus.
Aspergillus fumigatus es un patógeno oportunista por hongos y la causa fúngica más común de infecciones pulmonares invasivas en el huésped inmunocomprometido 1, 2. La comprensión de cómo las células inmunes del huésped reconocen y eliminan Aspergillus es un área importante de la investigación de hongos, sin embargo, los ensayos de fungicidas actualmente disponibles tienen limitaciones significativas. Métodos comúnmente utilizados para medir la actividad fungicida incluyen ensayos colorimétricos y la determinación de unidades formadoras de colonias 3, 4. Sin embargo, estos métodos proporcionan información sobre la viabilidad de hongos en un solo punto de tiempo en lugar de ver la interacción dinámica entre el huésped y patógeno. Por consiguiente, estos métodos no pueden tener en cuenta si un hongo ha muerto o simplemente (temporalmente) restringido en crecimiento o actividad metabólica. Hemos desarrollado un método capaz de observar fungiciactividad dal directamente, mientras que la captura simultáneamente la información detallada con respecto a la fagocitosis, la migración de fagocitos y la inhibición del crecimiento fúngico.
Anteriormente, un protocolo se publicó el uso de imágenes en tiempo real como un medio para medir la fagocitosis de Candida albicans por una línea celular de macrófago de ratón 5. Este concepto ha sido desarrollado para hacer frente a la falta de conocimientos en nuestra comprensión de las interacciones con las células inmunes de Aspergillus mediante la utilización de Aspergillus fluorescentes Reporter (brote) conidios 6, 7, 8. Estos conidios expresan un fluoróforo rojo (dsRed) y están marcados con un segundo fluoróforo (Alexa Fluor 633). Una vez que un conidio FLARE se mata, se deja de producir dsRed y la dsRed restante se desvanece, mientras que el AF633 permanece fluorescente y unido a los conidios. Esto crea una clara distinción entre fu viva y muertaNGAL células durante imágenes de células vivas y la citometría de flujo, y permite el seguimiento del destino de conidios individuales después de su interacción con las células inmunes.
Los ensayos descritos proporcionan un método eficaz de visualizar la interacción entre las células inmunes del huésped y Aspergillus y serán de valor considerable en el descubrimiento de las vías de señalización celulares responsables de los mecanismos efectores antifúngicos en las células inmunes innatas. Otras aplicaciones incluyen la visualización de cómo los cambios en el crecimiento de Aspergillus, tales como el cambio de reposo a conidios hinchada, hinchada o de conidios de hifas, afectan el reconocimiento de los fagocitos y función.
El siguiente protocolo describe en detalle cómo obtener los monocitos y neutrófilos humanos; cómo preparar los conidios FLARE; y la manera de capturar sus respuestas con el microscopio de vídeo y citometría de flujo. Aunque se describe el uso de células inmunes humanas aisladas de sangre del donante aquí, estetécnica ha demostrado igualmente eficaces usando una variedad de poblaciones de células murinas.
Este método describe un innovador método in vitro para estudiar la actividad antifúngica de fagocitos primarios humanos contra A. fumigatus utilizando fluorescentes Aspergillus Reporter (FLARE) conidios, imágenes de células vivas y citometría de flujo. Estudios anteriores han demostrado el valor añadido de la utilización de conidios FLARE tanto in vivo de la infección fúngica experimental murina y en la evaluación in vitro de la inmunidad antifúngica 6, 7. Combinando conidios con destellos con esta técnica de imagen de células vivas próxima generación permite una configuración para medir la viabilidad de los conidios individuales durante las interacciones dinámicas in vitro.
El método descrito tiene el potencial para investigar los papeles específicos y la importancia de ciertos procesos celulares de las células inmunes en sus respuestas antifúngicos. Además, las respuestas antifúngicas de los fagocitos de pacientes específicos que sufren dedefectos de componentes individuales definidos en su sistema inmune se pueden evaluar en mayor detalle. Muy tempranas y respuestas iniciales antifúngicos pueden ser estudiados en gran detalle más de 6 h de la imagen continua. Esto permite incluso diferencias sutiles para ser detectados, tales como la velocidad de la migración de fagocitos hacia el hongo, las tasas de internalización, dinámica de los acontecimientos fungicidas 12, lo que sería indistinguible utilizando métodos fagocitosis convencionales.
Cualquier tipo de célula podría ser utilizado con este método; Se seleccionaron los tipos de células utilizados aquí porque estos fagocitos constituyen la primera y segunda líneas de defensa en las vías respiratorias humanas contra A. fumigatus 13. Curiosamente, las diferencias muy claras se pueden observar entre cómo los monocitos y los neutrófilos se acoplan con reposo y conidios hinchado y hifas. Los monocitos migran a casi conidios, mientras que los neutrófilos muestran una actividad mucho más migratoria. mar fluorescente adicionalkers tales como marcadores-vivos muertos sobre las células inmunes pueden ser incluidos en el ensayo para proporcionar información sobre la supervivencia de los fagocitos siguiente interacciones con Aspergillus. Interés potenciales futuras aplicaciones de esta tecnología incluyen la co-cultivo de diferentes tipos de células huésped, las consecuencias para respuestas antifúngicos (por ejemplo, macrófagos en una monocapa epitelial, las células dendríticas derivadas de monocitos, junto con los neutrófilos), y la medición en tiempo real de reactivo la producción de especies de oxígeno o la formación de trampa extracelular de neutrófilos después de la estimulación con Aspergillus.
Unos pocos puntos necesitan ser observado para utilizar este protocolo, ante todo, la configuración de laboratorio requerido: un microscopio con una etapa invertida, una cámara ambiental estable a 37 ° C, y de excitación / filtros de emisión para dsRed (532/561 nm) y AF633 ( 633 nm). La capacidad del microscopio para mantener las células en el enfoque y retener el aceite de inmersión (especialmente relevante durante multi-punto de adquisición) se debe supervisar periódicamente debido a la larga duración de formación de imágenes. Para la cuantificación de la actividad fungicida de citometría de flujo se requieren instalaciones. Además, las aprobaciones institucionales y éticas apropiadas necesitan estar en lugar de trabajar con donante sano y las muestras de sangre del paciente derivada y hongos manipuladas genéticamente. Se recomienda encarecidamente el uso de muestras de sangre fresca (uso en el mismo día) para aumentar la viabilidad celular y preservar la funcionalidad. Idealmente, el aislamiento de las células se realiza inmediatamente después de dibujar las muestras de sangre y los neutrófilos se obtuvieron imágenes inmediatamente después del aislamiento.
En conclusión, una técnica de imágenes de células vivas próxima generación para evaluar en gran actividad antifúngica detalle fagocito contra se describe A. fumigatus. Esta tecnología puede proporcionar una visión única de las interacciones célula fúngica individuales en las primeras defensas inmunitarias innatas contra Aspergillus.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo ha sido financiado por el MRC y la Universidad de Aberdeen (MRC Centro de Micología Médica) y por el Premio Estratégica Wellcome Trust – Micología Médica hongos Inmunología (SFB, JMB, JK, AW). Un agradecimiento especial se da al apoyo del fondo Chloe. TMH es apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Salud (NIH, código 093808 SR1) y el Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering es apoyado por el NIH CA008748 P30 subvención. Además, TMH es un investigador en la patogénesis de la enfermedad infecciosa apoyado por el Fondo Burroughs Wellcome. Deseamos agradecer al Aberdeen Microscopía y Fondo Histología por su ayuda y apoyo.
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