여기, 우리는 라이브 셀 비디오 현미경과 함께 형광 아스 페르 길 루스 기자의 분생 포자를 이용하여 실시간으로 주요 인간 면역 세포의 항진균 활성을 평가하고 유동 세포 계측법 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 생성 된 데이터는 진균 작용, 식균 작용, 세포 이동 및 진균 성장 억제로 숙주 세포 – 아스 상호 작용에 대한 통찰력을 제공한다.
아스 페르 길 루스 푸 미가 투스의 높은 치명률과 면역 호스트에서 침습성 감염을 일으키는 기회 곰팡이 병원균이다. A.의 fumigatus에 대한 면역 반응을 조사하는 연구는 체외에서 특정 면역 세포의 항진균 활성을 측정하기위한 일관되고 신뢰할 수있는 분석의 부족에 의해 제한되고있다. 새로운 방법은 기본 단핵구 및 아스 형광 리포터 (FLARE) 분생 포자를 이용 A. 푸 미가 투스에 대하여 인간 공여자로부터의 호중구의 항진균 활성을 평가하기 위해 설명된다. 이러한 분생는 구조적 라이브 FLARE의 분생 포자로 표현되고, 외부에 따라서 실시간 죽은 A.의 미가 투스의 분생 구별을 허용하는 phagolysosome 내 분해에 내성 알렉사 형석 633으로 표시되는 유전자 인코딩을 DsRed 리포터를 포함한다. 비디오 현미경과 세포 계측법 이후 상호 작용을 시각화하는 데 사용됩니다 흐름분생과 선천성 면역 세포 간의 이온 역시 식세포 이동, 식균 작용 및 진균의 성장 억제에 대한 풍부한 정보를 제공하는 동안 살균 활성을 평가. 이 새로운 기술은 이미 A.의 fumigatus에 대한 주요 면역 세포의 호스트 – 병원균 상호 작용에 흥미 진진한 새로운 통찰력을 제공하고 있습니다. 필요한 현미경을 포함,이 분석을 수행하고 시설 유동 세포 계측법에 필요한 실험실 설정 및 인간 기증자의 혈액과 유전자 조작 곰팡이와 함께 작동 할 수있는 능력을 주목하는 것이 중요하다. 그러나 이러한 분석은 대용량의 데이터를 생성 할 수 있고 대응 곰팡이가 자세하게 밝힐 수있다. 이 프로토콜은 성공적 A.의 fumigatus에 대한 주요 면역 세포의 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는 데 사용되었습니다.
이는 필요한 현미경 포함한 상기 분석을 수행하기 위해 요구되는 실험 설정을 양해와 F 유동 세포 계측법 중요acilities 및 용량은 인간 기증자의 혈액과 유전자 조작 곰팡이와 함께 작동합니다. 그러나 이러한 분석은 대용량의 데이터를 생성 할 수 있고 대응 곰팡이가 자세하게 밝힐 수있다. 이 프로토콜은 성공적 A.의 fumigatus에 대한 주요 면역 세포의 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는 데 사용되었습니다.
아스 페르 길 루스 푸 미가 투스의는 기회 곰팡이 병원균과 면역 호스트 1, 2 침습적 폐 감염의 가장 흔한 곰팡이 원인이다. 곰팡이 연구의 중요한 영역 호스트 면역 세포가 인식하고 누룩 곰팡이를 제거하는 방법입니다 이해하지만, 현재 사용 가능한 살균 분석은 상당한 한계가 있습니다. 살 진균 활성을 측정하는 일반적으로 사용되는 방법은 비색 분석 및 집락 형성 단위 (3), (4)의 결정을 포함한다. 그러나, 이러한 방법은 하나의 시점에 오히려 호스트 병원체 간의 동적 상호 작용을 볼보다 진균 가능성에 대한 정보를 제공한다. 곰팡이가 사망하거나 (일시적으로) 성장 또는 신진 대사 활동에 제한되어 있는지 따라서, 이러한 방법은 고려하지 수 있습니다. 우리는 관찰 fungici 할 수있는 방법을 개발했다동시에 식세포, 식세포 이동 진균 성장의 억제에 관한 상세한 정보를 캡처하는 동안 직접 DAL 활동.
이전에는 프로토콜은 마우스 대식 세포주 5 칸디다 알비 칸스의 식균 작용을 측정하는 수단으로 실시간 영상을 사용하여 출판되었다. 이 개념은 이제 형광 아스 페르 길 루스 기자 (FLARE) 분생 포자 6, 7, 8을 이용하여 면역 세포와 아스 페르 길 루스의 상호 작용에 대한 우리의 이해의 지식 격차를 해결하기 위해 추가로 개발되었다. 이 분생 포자 빨간색 형광 (을 DsRed)을 표현하고 두 번째 형광 (알렉사 플 루어 633)로 표시되어 있습니다. 플레어 conidium가 살해되면, 그것은을 DsRed 생산을 중지하고 AF633은 분생 포자에 형광 및 바인딩 남아있는 동안 나머지는 DsRed는 페이드. 이 라이브와 죽은 쿵푸 사이에 명확한 구분을 만듭니다라이브 세포 이미징 동안 NGAL 세포와는 유동 세포 계측법 및 면역 세포와의 상호 작용 다음 각각의 분생 포자의 운명의 추적을 할 수 있습니다.
설명 된 분석은 숙주의 면역 세포 및 아스 퍼질러 스 상호 작용을 시각화하는 효과적인 방법을 제공하고 선천성 면역 이펙터 세포 곰팡이기구를 담당하는 세포 신호 전달 경로를 해명 상당한 가치가있을 것이다. 다른 응용 프로그램은 부어 분생 포자, 또는 부어 분생 포자에서 균사에 휴식에서 스위치로 아스 페르 길 루스 성장의 변화, 식세포 인식 및 기능에 미치는 영향을 시각화 등이 있습니다.
다음 프로토콜은 인간 단핵구와 호중구를 얻는 방법을 자세히 설명합니다; 어떻게 FLARE의 분생 포자를 준비하는 방법; 어떻게 비디오 현미경 자신의 응답을 캡처하고 유동 세포 계측법. 기증자의 혈액에서 고립 된 인간의 면역 세포의 사용은 여기에,이 설명되어 있지만기술은 쥐의 세포 집단의 다양한 사용하여 동일한 효과를 입증했다.
이 방법은 아스 형광 리포터 (FLARE) 분생 라이브 세포 이미징을 사용 A. fumigatus에 대해 인간의 기본 식세포의 항균 활성을 연구하고 유세포 시험 관내 방법에 혁신을 설명한다. 이전의 연구는 모두 쥐 실험 진균 감염의 생체 내 항진균 내성 (6, 7)의 시험 관내 평가에 FLARE의 분생 포자를 사용하는 부가 가치를 입증했다. 이 차세대 라이브 세포 이미징 기술로 FLARE의 분생 포자를 결합하여 체외에서 동적 상호 작용하는 동안 각각의 분생 포자의 생존 능력을 측정 할 수있는 설정이 가능합니다.
기술 된 방법은 자신의 항진균 응답에 면역 세포의 특정 세포 과정의 구체적인 역할과 중요성을 조사 할 가능성이있다. 고통 특정 환자 식세포 또한, 곰팡이 응답자신의 면역 체계에서 정의 된 단일 구성 요소 결함이 상세하게 평가 될 수있다. 아주 초기 초기 항진균 응답은 연속 영상의 6 시간에 걸쳐 아주 자세하게 연구 할 수있다. 이 같은 균류 향해 식세포 이동의 속도로, 미묘한 차이를 검출 할 수 있도록, 내재화 율, 종래 식세포 방법을 이용하여 구별하기 어려운 것 진균 이벤트 (12)의 동력학.
모든 세포 유형은이 방법으로 사용될 수있다; 이들 대 식세포는 A.의 미가 투스 (13)에 대해 인간기도 방어의 제 1 및 제 2 라인을 구성하기 때문에 여기에 사용 된 세포 유형을 선택 하였다. 흥미롭게도, 아주 명확한 차이가 단핵구와 호중구가 휴식 부어 분생 포자와 균사과 결합하는 방법을 사이에 관찰 할 수있다. 호중구는 더 많은 철새 활동을 표시하면서 단핵구는 거의 분생 포자로 마이그레이션하지 않습니다. 추가 형광 월이러한 면역 세포에 라이브 죽은 마커와 같은 KERS는 아스 페르 길 루스와의 상호 작용 다음 식세포의 생존에 대한 통찰력을 제공하기 위해 분석에 포함 할 수 있습니다. 이 기술의 흥미로운 잠재적 인 미래의 애플리케이션은 상이한 숙주 세포 유형의 공존 배양, 항진균 응답 결과를 포함한다 (예를 들면, 상피 단층 함께 호중구와 단핵구 유래 수지상 세포에 대 식세포) 및 반응의 실시간 측정 아스 페르 길 루스 자극 다음 산소 종의 생산 호중구 세포 트랩 형성.
을 DsRed (561분의 532 ㎚) 및 AF633 (위한 반전 스테이지 현미경, 37 ° C에서 안정한 환경 챔버 및 여기 / 발광 필터 : 몇 지점이 프로토콜 제일 실험실 필요한 설정을 사용하는 것이 주목해야 633 ㎚). m 중 특히 관련 (초점 세포를 유지하고 기름 침수를 유지하는 현미경의 능력ULTI 점 획득)으로 인해 영상의 긴 기간에 주기적으로 모니터링해야합니다. 진균 작용의 정량을위한 편의 시설이 필요 유동 세포 계측법. 또한, 적절한 제도적, 윤리적 승인은 건강한 기증자와 환자 유래 된 혈액 샘플과 유전자 조작 곰팡이 작업 할 자리에 있어야합니다. 강력하게 세포 생존을 증가시키고 기능을 유지하기 위해 신선한 혈액 샘플 (같은 날 사용)를 사용하는 것이 좋습니다. 이상적으로, 세포의 분리는 혈액 샘플 드로잉 직후에 수행되고 호중구 분리 직후에 묘화된다.
A. 푸 미가 투스를 설명한다 대하여 결론적으로, 차세대 생균 영상 법은 큰 세부 식세포 항진균 활성을 평가한다. 이 기술은 아스 페르 길 루스에 대한 초기 선천성 면역 방어에 개별 셀 곰팡이의 상호 작용에 대한 독특한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
의료 균류 학 곰팡이 면역학 (SFB, JMB, JK, AW) -이 작품은 MRC 및 애버딘 대학 (의료 균류 학에 대한 MRC 센터)에 의해 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 전략 수상에 의해 지원되었다. 특별한 당신이 클로이 기금의 지원을 주어 감사합니다. TMH는 NIH 보조금 P30의 CA008748에 의해 지원되는 국립 건강 연구소 (NIH, 코드 RO1 093808)과 기념 슬로안 케터링 암 센터에서 보조금에 의해 지원됩니다. 또한, TMH은 버로우즈 웰컴 기금에서 지원 감염증의 발병에 수사관이다. 우리는 그들의 도움과 지원을 위해 애버딘 현미경 및 조직학 시설을 감사드립니다.
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Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
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