الحضانة لفترات طويلة الحادة العصبية الأنسجة للالكهربية والكالسيوم التصوير

الكهربية والتصوير وظيفي (الكالسيوم، والجهد الأصباغ الحساسة) وهما من التقنيات التجريبية الأكثر شيوعا في علم الأعصاب. الدماغ الاستعدادات شريحة وwholemount في شبكية العين، والتي سيتم مناقشتها هنا، وتوفير وسيلة لدراسة الخصائص الكهربية واتصال متشابك دون تلوث من التخدير أو مرخيات العضلات. شرائح الدماغ وشبكية العين wholemount حفاظ على السلامة الهيكلية، على عكس الثقافات أو الخليط خلية، والسماح للدراسة دوائر محددة وشبكات الدماغ ^1. تسجيلات من الأنسجة المعزولة لها يتم استبعاد من المزايا أكثر في الجسم الحي التسجيلات الحركات المرتبطة ضربات القلب والتنفس. وعلاوة على ذلك، والتصور المباشر يسمح فئات معينة من الخلايا لتكون مستهدفة، والتطبيق المحلي للأدوات الدوائية ^{2 و 3.}

تسجيلات التصحيح المشبك وأحسبالبوتاسيوم صبغ التحميل في wholemount الشبكية معقدة بسبب وجود الداخلية الحد من غشاء (ILM)، الذي يغطي طبقة الشبكية العقدة الخليوي (RGC) ويمنع الوصول المباشر إلى الخلايا. عادة، يتم كشط هذا الغشاء بعيدا مع ماصة الزجاج للسماح التطبيق المباشر للماصة التصحيح وتشكيل ختم gigaohm على خلية واحدة. وبالإضافة إلى ذلك، والأصباغ الكالسيوم تطبيقها حمام لا تعبر ILM وإما أن يتم حقنه تحت هذا الغشاء ^4، نقل retrogradely حقن التالية في العصب البصري ⁵ أو electroporated من خلال الأنسجة ^6. وعلاوة على ذلك، عندما تستخدم نموذجا القوارض من التهاب الشبكية الصباغي، الماوس الثالثة / الثالثة، وILM هو أكثر سمكا وأكثر من ذلك لا يمكن اختراقها. هنا، ونحن نستخدم تقنية لإزالة ILM مع الهضم الأنزيمي ^7، للسماح كلا في كل مكان الكالسيوم صبغ التحميل، والوصول المباشر إلى خلايا الشبكية العقدة لrecordi التصحيح، المشبكخ ع ^8.

تعتمد التسجيلات ناجحة سواء من شرائح الدماغ أو wholemount في شبكية العين على تشريح وحضانة الأنسجة العصبية قابلة للحياة. عادة، يتم استخراج الأنسجة صباح يوم التجربة والمحتضنة في الاصطناعي السائل النخاعي (ACSF) حتى يتم استخدامها للتسجيلات. عادة، لا تزال الأنسجة قابلة للحياة 6-8 ساعة، مع تدهور كبير بعد هذه النافذة الوقت. ومع ذلك، كل شرائح الدماغ والاستعدادات الشبكية wholemount عادة ما تنتج المزيد من الأنسجة مما يمكن تسجيله من ضمن هذه الفترة الزمنية القصيرة. ونتيجة لذلك، غالبا ما يتم تجاهل الأنسجة في نهاية اليوم واكتمال تشريح مرة أخرى في الأيام اللاحقة. وهذا يعني يستخدم حيوان آخر و~ 2 ساعة من الإعداد وتشريح / تلطيخ المتكررة. يصف بروتوكول التالية وسيلة لإطالة حياة بعض الأنسجة العصبية لأكثر من 24 ساعة، وهذا يعني عددا أقل من الحيوانات تستخدم، والمزيد من الوقت التجريبي هو متاح. الأنسجة الحيوية ثكما تقييمها من خلال تسجيل الخصائص الكهربية وديناميات الكالسيوم، وكانت هذه الخصائص لا يمكن تمييزه بين <4 ساعات و> 24 ساعة postdissection.

وتشير هذه النتائج التي هي خصائص خلية واحدة سليمة وظيفية بعد حضانة طويلة فحسب، بل نشاط الشبكة، وفقا لتقييم الكالسيوم التصوير والتسجيلات الكهربية، هو دون تغيير> 24 ساعة postdissection. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن الأصباغ الكالسيوم يمكن أن يبقى في الخلايا لفترات طويلة دون أن تسبب أي آثار ضارة. تطبيق هذا البروتوكول يوضح أن النشاط الوظيفي للخلايا العصبية في الأنسجة العصبية الحادة يمكن أن يستمر لفترات طويلة، وبمجرد درجة عالية من التنظيم والبيئة الخارجية. وعلاوة على ذلك، كما الجدوى الأنسجة تختلف اختلافا كبيرا بين المختبرات بسبب البروتوكولات حضانة مختلفة، يحدد هذا الأسلوب معيار الذهب للمعلمات المثالية التي يجب تطبيقها للحد من التباين في صحة نوي الحادالأنسجة رونالد.